黑蒜中5-羟甲基糠醛含量的测定

2022-10-15苗亚琪顾晨程迮思露孔雅琪于楠楠陈学红

徐州工程学院学报(自然科学版) 2022年3期

苑蘅，苗亚琪，顾晨程，迮思露，孔雅琪，于楠楠，陈学红

(徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏徐州 222018)

黑蒜是大蒜在高温高湿条件下，各种物质相互作用而形成的新型深加工食品.与大蒜相比，黑蒜外观变黑、辛辣味消失、韧性增强、具有甜中带酸的独特风味，具有更加丰富的营养和生物活性[1-5].

5-HMF是焦糖化和美拉德反应的中间产物，是黑蒜色泽形成的关键物质[6-9].但是目前学术界对5-HMF的安全性存在争议：一方面研究表明5-HMF具有抗氧化、抗炎等生物活性，即使5-HMF含量较高的食品，正常食用剂量下不会对人体健康造成不良影响；另一方面也有研究表明5-HMF具有基因毒性，应限制食用[10-12].

目前，测定5-HMF的方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等[13-14].尽管有较多关于5-HMF检测方法的报道，但黑蒜是一个高糖微酸的复杂食品体系，为了提高检测的准确性，需要先对样品进行纯化.本课题根据黑蒜的特点，利用高效液相色谱法结合固相微萃取技术建立黑蒜中5-HMF的提取、纯化和检测方法，对科学地认识黑蒜的营养性和安全性、控制其加工品质具有重要意义.

1 材料与仪器

购买的黑蒜样品分别为云南独头黑蒜，云南多瓣黑蒜和山东多瓣黑蒜.

纯净水，中国杭州娃哈哈集团有限公司；5-HMF，98%，北京百灵威科技有限公司；甲醇、甲酸，色谱纯 99.9%，北京百灵威科技有限公司.

LE204E/02电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；GE Ultrospec 7000/7000PC紫外-可见光分光光度计，英国柏楉有限公司；UltiMate 3000高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技有限公司；Sepax HP-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱，美国赛分科技有限公司；SBEQ-CG1012 管固相萃取真空装置，上海安普实验科技股份有限公司；Universal 320R台式高速冷冻离心机，广州深华公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；TM-1F涡旋振荡器(Turbo Mixer Vortex)，德国维根公司(WIGGENS)；B101思乐谊搅拌器,冠鑫兴业股份有限公司；Scientz-18N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；UA22MFD超声清洗机，德国维根公司(WIGGENS).

2 试验结果与分析

2.1 HPLC参数确定

2.1.1 5-HMF最大吸收波长的确定

用电子天平准确称取0.097 5 g的5-HMF标准品，用纯净水定容至10 mL容量瓶内，配置成质量浓度为9.75 mg/mL的5-HMF水溶液，用移液器取100 μL该溶液，定容至100 mL容量瓶内，配置成9.75 μg/mL的5-HMF水溶液.在紫外-可见光分光光度计上设定检测范围为190～400 nm，扫描间隔为0.2 nm，将纯净水作为空白对照，进行检测.5-HMF标准品紫外吸收光谱如图1所示，5-HMF最大吸收波长在283.8 nm处.

图1 5-HMF紫外吸收光谱图

2.1.2 5-HMF出峰时间确定

准确称取0.113 1 g 5-HMF标准品，配置成11.31 mg/mL 5-HMF甲醇溶液，再稀释至11.31 μg/mL 5-HMF甲醇溶液.流动相为体积分数0.1%甲酸甲醇溶液-0.1%甲酸水溶液(体积比1∶9),检测波长为284 nm.5-HMF标准品高效液相色谱(HPLC)如图2所示，5-HMF的出峰时间在约14 min.

图2 5-HMF的HPLC图

2.2 标准曲线及相关系数

用体积分数5%甲醇溶液配制质量浓度为64.04 μg/mL的5-HMF标准溶液，并依次稀释至32.02、16.01、8.00、4.00、2.00 μg/mL.用0.4 μm针孔过滤器过滤进行测定，计算相关参数.以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制5-HMF标准曲线，如图3所示.回归方程为：y=1.512 0+2.295 5x(R2=0.999 96)，线性范围：2.00～64.04 μg/mL.

图3 5-HMF标准曲线

2.3 方法的检出限和定量限

方法检出限(LOD)是指样品中待检测成分能被检测到的最低量，一般是作为定性检出用.而定量限(LOQ)则是指样品中待检测成分能被定量测定的最低量，其检测结果需具备一定的准确性和精密度，一般在定量分析用方法中使用.信噪比为10，测得定量限；信噪比为3，测得检出限.平行进行10次试验，确定5-HMF测定方法的检出限为1.2 ng/mL，定量限为4 ng/mL.

2.4 精密度试验

精密移取标准溶液(16.01 μg/mL)20 μL，连续测定4次.精密度试验结果如表1所示.RSD为0.66%，小于5%，精密度良好.

表1 精密度试验结果

2.5 回收率

以黑蒜样品为基底进行加标回收率试验，取1 mL供试液加入10 μL的10.09 mg/mL的5-HMF标准样品，进样测定加标样品中5-HMF的平均值，计算回收率.结果如表2所示.回收率在80%～120%，回收率良好.且RSD为0.7%，小于5%，稳定性良好.

表2 5-HMF回收率考察结果

2.6 提取条件优化

2.6.1 SPE小柱优化

先后用3 mL甲醇和3 mL水活化安普CNWBOND LC-C18 SPE，精准加入样品0.5 mL，分别收集以3 mL水和3 mL甲醇洗脱的溶液，通过旋转蒸发器进行浓缩后以体积分数5%甲醇溶液进行复溶，定容到5 mL容量瓶中.用HPLC测定5-HMF含量，并计算得率.再重复上述步骤分别测定安普CNWBOND HC-C18 SPE，安普Poly-Sery HLB SPE的得率，得到各小柱得率.以SPE小柱种类为横坐标，回收率为纵坐标作图，结果如图4所示.P<0.05，NS表示无统计学意义.

*:P<0.05；NS:无统计学意义

从图4可知，小柱种类对回收率有统计学意义，且用HLB小柱过柱得到的5-HMF回收率最低，而使用HC-C18小柱得到的回收率略优于HLB小柱，LC-C18小柱的回收率最高，效果最好，故选择LC-C18小柱.

2.6.2 超声时间优化

精密称取8 g云南独头黑蒜样品，以40 mL水混合均匀，依次编号后分别超声10、20、30 min.将超声后的黑蒜溶液放入冷冻离心机中，在9 000 r/min，20 ℃下离心20 min.上清液经布式漏斗抽滤后，定容至100 mL.取1 mL过LC-C18小柱，用20 mL甲醇溶液洗脱，洗脱液用旋转蒸发器旋干后，以体积分数5%甲醇水溶液复溶至5 mL，经过0.4 μm针孔过滤器过滤后，用HPLC测定，得到不同超声时间下5-HMF浓度.

以超声时间为横坐标，5-HMF质量分数为纵坐标绘制曲线，结果如图5所示.由图5可知，超声时间对黑蒜中5-HMF的提取率具有显著影响，主要呈先上升再下降的趋势.当超声时间为20 min时，5-HMF质量分数最高，为0.026 13%,高于超声时间10 min时5-HMF质量浓度，并显著高于超声30 min时质量分数，故超声时间取20 min.

ab: P=0.05水平上的显著性差异比较；AB: P=0.01水平上的显著性差异比较

2.6.3 提取次数优化

精密称取8 g云南独头黑蒜样品以40 mL水混合均匀，依次编号.超声20 min后，放入冷冻离心机中，在9 000 r/min，20 ℃下离心20 min.上清液经布式漏斗抽滤后，收集上清液.1、2号定容至100 mL，作为提取1次的样品.3～6号以20 mL水复溶，超声20 min，离心20 min，抽滤后收集上清液，3、4号定容至100 mL，作为提取2次的样品；5、6号以20 mL水复溶，超声20 min，离心20 min，抽滤后收集上清液，定容至100 mL，作为提取3次的样品.分别取1 mL过LC-C18小柱，用20 mL甲醇溶液洗脱，洗脱液用旋转蒸发器旋干后，以体积分数5%甲醇水溶液复溶至5 mL，经过0.4 μm针孔过滤器过滤后，用HPLC测定，得到不同提取次数下5-HMF质量分数.以提取次数为横坐标，5-HMF质量分数为纵坐标绘制曲线，结果如图6所示.

abc：P=0.05水平上的显著性差异比较；AB: P=0.01水平上的显著性差异比较

由图6可知，不同提取次数在5-HMF质量分数上有统计学意义，且随着提取次数的增加，5-HMF质量分数较为明显增长，且提取次数为3次时最大，故选择提取次数为3次.

优化后黑蒜样品前处理的步骤为：精密称取下样品8 g，以40 mL水混合均匀.超声20 min后，在9 000 r/min,20 ℃下离心20 min,抽滤.复溶，超声20 min，离心20 min,抽滤.再次复溶，超声20 min，离心20 min，抽滤后，所有溶液一起定容至100 mL.取1 mL过LC-C18小柱，用20 mL甲醇溶液洗脱，洗脱液用旋转蒸发器旋干后，以体积分数5%甲醇水溶液复溶至5 mL.

2.7 不同产地黑蒜中5-HMF含量

分别取足量的云南独头黑蒜，云南多瓣黑蒜和山东多瓣黑蒜切片后，置于-20 ℃下冰冻干燥12 h.将冰冻干燥后的黑蒜放入冷冻干燥机内，-100 ℃下冷冻干燥24 h.取出后放入研钵中，加入液氮.迅速将被液氮冷却的黑蒜放入搅拌器中搅拌均匀至粉末状，做好标记，密封备用.

精密称取云南独头黑蒜样品8 g，以40 mL水混合均匀.在超声清洗机中超声10 min后，放入冷冻离心机中，在9 000 r/min、20 ℃下离心20 min.将上清液经布式漏斗抽滤，定容至100 mL容量瓶内.取1 mL过LC-C18小柱，用20 mL甲醇溶液洗脱，洗脱液用旋转蒸发器旋干后，以体积分数5%甲醇水溶液复溶至5 mL，经过0.4 μm针孔过滤器过滤后进行HPLC检测.以黑蒜品种为横坐标，5-HMF质量分数为纵坐标绘制曲线，结果如图7所示.

图7 不同品种黑蒜中5-HMF质量分数

由图7可知，云南独头黑蒜，云南多瓣黑蒜和山东多瓣黑蒜的5-HMF质量分数分别为0.025 9%、0.177 7%、0.064 4%.云南多瓣黑蒜的5-HMF含量最高，且显著高于另外两个品种的黑蒜，云南独头黑蒜的含量最低.这可能是由于黑蒜在制作过程中，多瓣黑蒜比独头黑蒜的比表面积大，内部温度更高，所以更易形成5-HMF.该方法测定黑蒜中5-HMF含量时，可以排除杂质的干扰，较为准确地反应出黑蒜中5-HMF的含量.