山茱萸总酚酸提取及抗菌活性成分分析

刘玮炜，邵仲柏，陈 超，吴玉宇，苏子钦，梁馨文，高田田，邱 敏，郭 雷

(江苏海洋大学 a.药学院；b.江苏省海洋生物资源与环境重点实验室；c.江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室；d.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005)

目前我国水产生态养殖业发展迅速，由于其具有集约化程度高、规模大、密度高等特点，易导致弧菌病爆发频率的逐步提升、传播速度的不断加快，严重影响了水产生态养殖的进一步发展[1-2].弧菌性疾病是危害水产生态养殖最严重的疾病之一[3-4]，水产养殖中如弧菌病治理不当，易引发食品安全问题，给人类健康带来巨大危害[5-6].当前，治疗弧菌病主要使用抗生素类药物，但其长期过量使用，不仅导致水生环境中的弧菌产生耐药性，而且水产品中的残留给人体健康带来巨大危害[7-8].大多数中草药具有广谱抗菌、来源广、价格便宜、绿色安全、不易产生耐药性等优点[9-10]，与抗生素作用不同，在防控疾病方面主要是通过提高水产养殖动物的非特异性免疫而达到抗菌效果的[11]，所以用中草药替代抗生素作为新型弧菌抑制剂在我国具有较高的研究价值.

山茱萸(Cornusofficinalis)作为山茱萸科植物[12]，在我国分布范围广泛，其药用价值高[13-14]，最早被《神农本草经》所记载.山茱萸中有效成分的生物活性众多，如抗菌、抗氧化、利尿、抗癌等[15-16].Shu等[17]认为山茱萸酚酸类物质能较好抑制金黄色葡萄球菌与金芽孢杆菌.Brindza[18]研究发现山茱萸中熊果酸对大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和黑曲菌均有较强的抑制作用.本课题组前期首先进行了山茱萸、沙棘、藿香等13种中草药抑制哈氏弧菌、副溶血弧菌活性的筛选实验，并将山茱萸乙醇提取物与阳性对照大蒜素进行活性对比，发现13种中草药中山茱萸乙醇提取物抑制弧菌活性最好，同时山茱萸乙醇提取物的活性强于大蒜素；其次，利用大孔吸附树脂柱层析和薄层层析法对山茱萸乙醇提取物进行分离得到了3个组分，并采用化学定性检测法对3个组分进行鉴定，初步判定山茱萸抑菌活性成分为酚酸类化合物.因此，本研究对山茱萸总酚酸提取工艺[19]进行优化，对其抗弧菌活性成分进行初步研究，以期为山茱萸总酚酸资源开发、水产养殖业中弧菌性疾病防治提供借鉴.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山茱萸粉末，购自安徽毫州中药厂，过80目筛，备用；指示菌为哈氏弧菌，购自中国普通微生物菌株保藏管理中心，由本实验室保存.

试验用没食子酸(CAS号：149-91-7)、Folin-酚试剂，江苏艾康生物医药研发有限公司；MH肉汤、海盐、琼脂粉，上海蓝季生物有限公司；无水乙醇(EtOH)、石油醚(PE)、二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(nBuOH)为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；柱色谱硅胶(200～300目)、Sephadex LH-20凝胶柱，Pharmacia公司.

1.2 试验方法

1.2.1 山茱萸总酚酸的提取

定量称取干燥的山茱萸粉末10.0 g，置于500 mL三口瓶中，加入150 mL一定体积分数的乙醇溶液，设置超声功率225 W、超声温度50 ℃.在一定时间内，先超声破碎，后回流提取，减压抽滤，重复2次.收集2次滤液后浓缩，置于10 mL容量瓶中进行定容，测定其在755 nm波长处的吸光值.

1.2.2 山茱萸总酚酸提取得率的测定

1.2.3 单因素试验

分别考察乙醇含量(体积分数20%、40%、60%、80%、100%)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g)、超声持续时间(15、30、45、60、75 min)、回流时间(30、60、90、120、150 min)和回流温度(30、40、50、60、70 ℃)对山茱萸中总酚酸提取得率的影响.

1.2.4 Plackett-Burman筛选试验中的关键因素

以单因素的试验结果为基准，将总酚酸得率视为响应值(Y)，对乙醇含量(X1)、液料比(X2)、超声持续时间(X3)、回流时间(X4)及回流温度(X5)5个影响因素进行评价，筛选出主效应因子，每个因素取最低(-1)和最高(1)2个水平，共12组试验.主要试验因素和水平的取值见表1.

STS教育就是在STS思想指导下，为培养了解科学技术、能积极参与科学技术相关社会问题的决策、具有一定科学素养的公民而进行的一种教育，突出科学技术在个人和社会方面的应用以及科学、技术和社会之间的相互作用。

表1 Plackett-Burman试验设计的因素和水平

1.2.5 响应曲面法优化试验

以Plackett-Burman的试验设计结果为基础，通过选择乙醇含量(A)、超声持续时间(B)、回流时间(C)3个因素，完成了3因素3水平的Box-Behnken试验设计，以筛选最佳工艺.具体试验因素和水平的取值见表2.

表2 Box-Behnken试验设计的因素和水平

1.2.6 抗弧菌活性成分分析

将提取的山茱萸总酚酸溶液进行减压浓缩，得到山茱萸浸膏.用适量蒸馏水溶解浸膏，依次用PE、DCM、EA、nBuOH萃取，减压浓缩，得到5个不同萃取部位.结合不同极性部位对哈氏弧菌的抑制效果进行活性追踪，发现EA部位抗哈氏弧菌活性最强，故而确定其作为下一步研究对象.

过硅胶柱，以DCM∶MeOH(10∶1～0∶1)进行洗脱，分离出7个组分(Fr.1～Fr.7).通过活性追踪，将抗哈氏弧菌活性最强的组分Fr.6再次过硅胶柱，以DCM∶MeOH(20∶1～0∶1)进行洗脱，分离出组分Fr.6.1～Fr.6.6，其中Fr.6.2(化合物1)为淡黄色结晶.但此时通过活性追踪发现，组分Fr.6.5活性最强，故对其进行凝胶柱层析，以MeOH为洗脱剂，TLC点样，相同组分合并，得到组分Fr.6.5.1～Fr.6.5.5，其中Fr.6.5.4(化合物2)为白色结晶.利用1H NMR、13C NMR及ESI-HRMS对化合物1、2进行结构鉴定.

2 结果与分析

2.1 单因素对山茱萸总酚酸得率的影响

2.1.1 乙醇体积分数对山茱萸总酚酸得率的影响

当乙醇体积分数为20%～60%时，山茱萸总酚酸得率随着乙醇体积分数上升而升高，并在60%时达到最高，而当乙醇体积分数为60%～100%时，总酚酸得率逐渐下降(图1).乙醇与水按照不同比例混合后配成梯度浓度溶剂，而不同梯度浓度的乙醇溶液对植物中化学物质溶出度有一定影响，因此确定乙醇体积分数为60%.

图1 乙醇体积分数对山茱萸总酚酸得率的影响

2.1.2 液料比对山茱萸总酚酸得率的影响

图2 液料比对山茱萸总酚酸得率的影响

2.1.3 超声持续时间对山茱萸总酚酸得率的影响

山茱萸总酚酸得率在超声持续时间为60 min时达到最大，而当超声持续时间大于60 min时，得率急剧下降(图3).其原因可能是当超声持续时间为60 min时，山茱萸中总酚酸质量浓度与60%乙醇提取溶剂中总酚酸的质量浓度达到动态平衡；而当其超过60 min后，超声处理会明显升温，造成物质活性丧失，故得率随之下降.因此，确定超声持续时间为60 min.

图3 超声持续时间对总酚酸得率的影响

2.1.4 回流时间对山茱萸总酚酸得率的影响

山茱萸总酚酸得率随着回流时间增加而增大，到120 min时达到最大，随后下降(图4).这可能是因为随着提取时间延长，总酚酸被氧化导致得率下降.因此,确定回流时间为120 min左右.

图4 回流时间对总酚酸得率的影响

2.1.5 回流温度对山茱萸总酚酸得率的影响

山茱萸总酚酸得率在温度为50 ℃时达到最大.当温度超过50 ℃时，得率呈缓慢下降趋势(图5).推测是由于总酚酸类物质热稳定性不好，长时间高温加热易被氧化，导致部分总酚酸类物质丢失，得率下降.因此,选择回流温度为50 ℃左右.

图5 回流温度对总酚酸得率的影响

2.2 关键因素的确定

采用Design-Expert 10.0.7软件对表3中的数据进行多元回归分析，得到山茱萸总酚酸得率为响应值的最优方程为：Y=3.043+0.196X1+0.057X2-0.106X3-0.115X4+0.068X5，且得到方差分析结果，见表4.由表4数据，根据效应值的大小可知影响山茱萸总酚酸得率的关键因素依次为：X1>X3>X4>X5>X2.其中乙醇含量X1、超声持续时间X3对山茱萸总酚酸得率的影响达到极其显著水平(P<0.01)，回流时间X4则达到显著水平(P<0.05)，而回流温度X5和液料比X2影响不显著.故选择乙醇含量、超声持续时间、回流时间3个关键因素进一步进行响应面优化实验.通过观察单因素实验的结果，并综合考虑成本、效率等方面，将液料比和回流温度这2个因素分别固定为15∶1(mL/g)和50 ℃.

表3 Plackett-Burman试验设计及结果

表4 Plackett-Burman试验方差分析结果

2.3 响应面分析的优化

采用Design-Expert 10.0.7软件对表5中数据进行处理，获得总酚酸得率(Y)对乙醇含量(A)、超声持续时间(B)以及回流时间(C)的二次多项回归方程：Y=4.27+0.20A+0.22B-0.24C+0.11AB+0.061AC+0.17BC-0.43A2-0.80B2-0.59C2.对回归模型进行方差分析，结果见表6.由表6数据可知，该回归模型P<0.000 1(极显著)，失拟项P=0.906 5>0.05(不显著)，说明该回归模型可靠，可用于山茱萸总酚酸得率的优化.并且，模型决定系数R2为0.992 5，表明拟合度较好；校正决定系数R2为0.982 8，表明预测值与实际值相关性高，所以此回归模型可用于分析、预测山茱萸总酚酸得率.此外，在该回归模型中，二次项AB对山茱萸总酚酸得率的影响达到显著水平(P<0.05)，而A、B、C以及BC、A2、B2、C2则为极显著水平(P<0.01)，AC无显著影响.各因素响应面如图6所示.

表5 Box-Behnken试验设计及结果

表6 回归模型方差分析结果

图6 各因素响应面图

2.4 验证性试验结果

通过软件进一步分析得到最佳工艺条件为乙醇体积分数62.35%、超声持续时间61.33 min、回流时间116.53 min.在此条件下，山茱萸总酚酸得率最大理论值为4.324 mg/g.考虑到实际生产条件，将最佳工艺条件调整为乙醇体积分数60%、超声持续时间60 min、回流时间115 min.在该条件下进行平行试验验证，测得总酚酸得率平均值为4.307 mg/g，而预测值为4.324 mg/g，两者结果接近，相对误差为0.39%，表明该模型具有较高的准确度.

2.5 活性成分结构表征

化合物1：淡黄色固体，ESI-MS m/z 171.026 7[M+Na]+；1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:4.35(dd,J=7.5, 5.1 Hz, 1H,C-H),3.63(s,3H,CH3), 2.63(dd,J=15.8, 5.1 Hz,1H,CH),2.49(dd,J=15.8,7.5 Hz,1H,CH).13C NMR(126 MHz,DMSO-d6)δ=173.82(C-1),172.05(C-2),67.48(C-3),52.10(C-4),39.60(C-5).通过与文献[21]数据对比，确定化合物1为2-羟基丁二酸-1-甲酯，其结构式见图7.

图7 化合物1的结构

化合物2：白色无定形粉末，ESI-MS m/z 169.0163[M-H]+；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ:12.21(s, 1H, COOH),9.18(s, 2H, OH),8.81(s, 1H, OH),6.92(s, 2H, Ph-H);13C NMR(126MHz, DMSO-d6)δ:167.93(C-7),145.8(C-2,6),8.81(C-4),109.19(C-3,5).通过与文献[22]数据对比，确定化合物2为3,4,5-三羟基苯甲酸(没食子酸)，其结构式见图8.

图8 化合物2的结构

3 结语

通过单因素试验、Plackett-Burman试验以及Box-Behnken设计，优化山茱萸总酚酸提取工艺，得到最优提取条件为液料比15∶1 mL/g、回流温度50 ℃、乙醇体积分数60%、超声持续时间60 min、回流时间115 min.在该条件下，山茱萸总酚酸的得率为4.307 mg/g.另外，通过硅胶柱、凝胶柱层析及活性追踪，初步探究山茱萸中抑制弧菌的活性成分，最终分离得到2个化合物,即2-羟基丁二酸-1-甲酯和没食子酸.本文为山茱萸抑制弧菌活性成分的进一步研究提供了借鉴，以求推动水产抗菌药的开发.