阿旺绵羊种公羊精液冷冻保存技术的研究

2022-10-15李建强杨志勇林耀民王幸栓雷安民

畜牧兽医杂志 2022年5期

李建强，杨志勇，林耀民，赵赫，王幸栓，虞莲，雷安民

(1.天津津垦牧业集团有限公司，天津300380；2.西北农林科技大学；3.天津农垦龙呈嘉益国际贸易有限公司；4.天津天食牛种业有限公司)

阿旺绵羊是西藏具有代表性的藏系绵羊(周雨等，2018)，全身各部结合匀称，体躯呈长方形，在“三江”型绵羊中体格最大，生产性能最好(宋天增等，2016)，具有适应在海拔高、气温低、昼夜温差大、牧草生长期较短、氧气压低等环境地区生存的特点，是青藏高原高寒牧区或半农半牧区放牧或舍饲饲养的优良肉用绵羊品种类群(扎西等，2016)，是西藏宝贵的优良遗传资源(德庆卓嘎，2015)。阿旺绵羊主要分布于西藏昌都地区贡觉县境内的阿旺乡、拉妥乡、莫洛乡等12个乡(镇)及周边的芒康县、江达县、察雅县等地，是千百年来牧民在自然放牧条件下，经过长期的闭锁繁育和民间自然选育而形成的一个优良绵羊类群(洛桑催成等，2018)。阿旺绵羊的饲养管理主要是采取全年放牧方式进行饲养(扎西等，2011)，且属于季节性繁殖动物(德庆卓嘎，2015)，以自然本交为主。但近年来，随着西藏农牧民生活水平的提高和饮食习惯的影响，阿旺绵羊杂交情况严重，数量急剧减少。而精液冷冻可大大提高种公畜的利用率，减少公畜的饲养量，节约成本且不再受地域、时间的限制。不仅有利于家畜品种改良，也是家畜育种和珍惜濒危物种保护的有效技术手段。本试验研究，通过调教纯种阿旺绵羊种公羊进行人工采集精液，制成冷冻精液，探索优质阿旺绵羊种公羊遗传资源的保护，提高其利用率，并为阿旺绵羊快速扩繁奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及地点

1.1.1 动物选择从位于4 200 m海拔的西藏昌都市畜牧总站觉拥种畜场选取符合阿旺绵羊品种特征的2～4周岁优质种公羊个体70只，身体健康，经检疫无传染性疾病。

1.1.2 实验地点西藏昌都，昌都津垦牧业科技有限公司(海拔3 200 m)。

1.2 实验材料

1.2.1 主要实验设备干热灭菌器(GRX-9123A，中器)；超净工作台(BBS-SDC，博科)；超净水制作仪(CR-20N，杲森)；高压灭菌锅(SX-500，TOMY)；数显水浴锅(DK-S24，中器)；镜检加热器(Sipert-jj0201，世博)；2～8 ℃医用冰箱(YC-1006，澳柯玛；精液采集器(康力)；相差显微镜(BX43，奥林巴斯)；分析天平(Q65，赛多利斯)；自增压液氮罐(230MP，CHART)；密度仪(羊)(Accucell，卡苏)；超低温程序降温仪(007263 Min-Digitcool，卡苏)；低温操作柜、全自动单头精液细管灌装机(022989 MRS1，卡苏)；日粮制备机(ST70，北京国科诚泰农牧设备有限公司)等。

1.2.2 主要试剂稀释液(optixcell)(卡苏)。

1.3 种公羊的调教

1.3.1 饲养管理按照种公羊营养需要，以颗粒精料、燕麦草为主要原料，通过日粮制备机制成全混合日粮，撒料车送料，2次/d。羊栏内悬挂矿物质舔砖，随意舔食。自来水，自由饮水。下午放牧运动2 h。

1.3.2 种公羊调教 (1)调教前适应工作：阿旺绵羊以放牧为主，胆小易惊，怕人。所以，对阿旺绵羊进行调教，首先是增加人羊的接触，降低其恐惧感。通过人工饲喂草料、人与羊主动接触等，减少羊与人之间的陌生感和恐惧感，增强其与人近距离接触的适应性。(2)台羊的选择：选择身体健壮、个体适中、性情温顺的阿旺绵羊母羊为台羊，颈部固定到台羊架上，左右有栏杆限制台羊活动。发情母羊效果更好。(3)采精器械准备：在调教的前一天，用75%的酒精棉消毒假阴道内胎，注入适量水后，放入干热灭菌器(45℃)。调教当天，采精人员身穿工作服，佩戴口罩和一次性采精手套，将假阴道从干热灭菌器中拿出，并用灭菌玻璃棒在其上端2/3处涂抹适量润滑油，吹起加压使其内胎外口呈三角形状，安装集精杯后，手持假阴道安静等待。(4)采精调教：选择2～3只不相互攻击的种公羊，将其驱赶至采精区域后，离开，并间歇性进入以保证待调教公羊位于台羊附近。待调教公羊爬跨台羊且稳定时，采精人员迅速将公羊阴茎导向精液采集器上口处，待公羊完成射精动作后，随公羊阴茎而下，移除精液采集器。将假阴道放平并旋松阀门放气，拧紧并将竖直、轻拍，以使精液全部流入集精杯，再将集精杯通过窗口递到精液处理室做进一步原精质量检查和记录。

1.4 冷冻精液制作

1.4.1 技术标准参照《羊冷冻精液生产技术规程》(NY/T 3186-2018)进行阿旺绵羊精液采集、检验及冷冻精液制作。

1.4.2 采精前的准备 (1)采精前一天，假阴道的处理同调教，其他准备主要包括：①分装精液所需的灌装软管、精液漏斗经75%酒精浸泡消毒处理后烘干放置到超净工作台中；②长灌装针头、锥形瓶、集精管、量筒等经高温消毒后备用；③集精杯、移液枪吸头经超净工作台紫外线照射消毒；④计算第二天稀释液的用量需求，用锥形瓶接取超纯水，用牛皮纸封口后放入高压灭菌锅中灭菌(121 ℃，30 min)。(2)采精当天，在采精之前，需要做如下准备：①密度仪、数显水浴锅(34 ℃)、镜检加热器(上面有洁净的载玻片、盖玻片，37 ℃)、低温操作柜(4 ℃)等通电、开机；②密度仪预热后，将盛有3.99 mL生理盐水的比色皿放入其中进行空白对照测定；③将集精管安装到集精杯中，经分析天平称量重量(初重)后，放置在已备好精液采集器的干热灭菌器内；④稀释精液所需的锥形瓶放置到盛有34 ℃水的500 mL塑料烧杯内，将烧杯放到水浴锅中水浴加热；⑤细管(0.25 mL)装入烧杯后紫外线消毒；⑥稀释液的准备：按照需求，依据说明书将稀释液(optixcell)用灭菌超纯水稀释后，将其放置到水浴锅中水浴加热备用；⑦台羊固定，并将调教好的种公羊和待调教的公羊驱赶至待采栏。

1.4.3 人工精液采集 (1)采精步骤：与调教时相似，不同之处在于，对于胆子较大的种公羊空爬两次后，再采集精液；而胆子较小的种公羊爬跨就采精，否则很有可能当日不再爬跨。并对待调教的公羊继续调教。(2)采精频率：一般每只羊每周采精两次。如果羊只采精的精液量显著少于其正常精液量范围，可以间隔30 min以上，再采精一次。

1.4.4 原精品质检测、稀释及记录 :(1)射精量(精液体积，mL)计算：将人工精液采集完成后的集精杯放到分析天平内称重(总重)，精液体积(mL)=(总重-初重)/1.03(精液比重)。(2)密度检测：用移液器在称重后集精杯中取精液(原精)10 μL，并用面巾纸擦去吸头外沾到的精液，然后在比色皿的生理盐水中反复吹打并将原精注入其中，将集精杯放置到镜检加热器上，再按照密度仪操作步骤检测得出阿旺绵羊精液的密度(亿/mL)、分装支数(支)和加液量(mL)。(3)稀释及原精活力检测：待计算出加液量后，量取稀释液后，反复2～3次涮洗集精管，并倒入已准备好的锥形瓶中进行稀释，轻轻晃动摇匀，取6 μL原精放到显微镜的载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下评判原精活力。或者是向集精杯的原精中先加入5～10 mL稀释液并倒入锥形瓶，判断活力≥65%之后，再按照加液量进行加液。之后，将稀释完毕的精液(锥形瓶，烧杯中)放到低温操作柜内平衡3～4 h。(4)信息记录：在检测过程中，应及时记录羊只的耳号、体积、密度、分装支数、加液量、原精活力等。

1.4.5 精液分装和冷冻 (1)信息打印：按照每只公羊的分装支数使用多米诺喷墨打印机打印所需0.25 mL细管(打印信息包括：地区、公司、耳号、生产日期)，每只公羊的细管放入不同盒内。(2)分装：将打印信息后的细管码装到冷冻架上，码放时应注意细管摆放方向，把棉塞封口端靠近操作者，超声波封口端远离操作者。然后将平衡后的精液轻轻晃动混匀后倒入精液漏斗内，同时将长灌装针头、罐装软管和细管进行组装，再将细管放置到精液漏斗里并直达底部，然后通过全自动单头精液细管灌装机分装精液，并记录每只公羊细管精液的冷冻架数字。如此反复循环，将所有羊只精液进行分装。(3)冷冻：将冷冻柜的所有冷冻架放置到冷冻柜内，有细管的冷冻架放在上面，无细管的冷冻架放在下面。然后按照超低温程序降温仪的程序，完成精液冷冻。(4)暂存：冷冻完成后，打开冷冻柜盖子，冷冻精液(冻精)细管的超声波封口端在上，棉塞封口端在下，不得倒置，以免细管棉塞端的暴脱，按公羊号投入盛满液氮的不同提筒中，并迅速浸泡在液氮罐中暂存。

1.4.6 冻后活力检测及贮存 (1)冻后活力检测：预先把水浴箱水温、镜检加热器加热至 37 ℃，将装有试管的试管架放置其中，并标记上需要质检的羊只耳号。然后用镊子取每个日期每只羊的一支冷冻细管精液迅速浸泡于水中并迅速晃动3～4下，然后取出，用纱布擦干水珠，然后剪去超声波封口端，用推针推动棉塞端将细管内的精液全部置于小试管内，混均匀后，取6 μL精液置于载玻片上，加盖玻片进行活力检测和评定。 (2)分装贮存：将质检合格的冷冻精液分装到拇指管中，再装入纱布袋中，并在纱布袋的标签上标注羊只耳号、生产单位、冷冻精液支数和冷冻制作日期。然后将其浸泡到液氮罐的液氮中贮存。并且，根据液氮挥发情况，专人负责加添液氮，每周1～2次，以保证冷冻精液始终浸入液氮内。同时注意库房通风。

1.5 统计分析

2 结果与分析

阿旺绵羊采精调教结果。通过反复多次调教训练，21只阿旺绵羊种公羊能够进行人工精液采集。

阿旺绵羊原精和冻精质量(样本数116个，1个月)总体情况见下表。

表1 阿旺绵羊原精和冻精质量情况(样本数116个)

从表1中我们可以看出，阿旺绵羊原精和冻精的总体质量情况显著高于《羊冷冻精液生产技术规程》。

(3)不同阿旺绵羊个体间原精和冻精质量(14只)的比较。

从表2中我们可以看出，在14只人工采集精液的阿旺绵羊原精和冻精质量情况中，在体积方面，羊1与羊12，羊4、羊6、羊14与羊11，羊7、羊9、羊10与羊11、羊13，羊12与羊13，均差异显著。在密度方面，羊1、羊2、羊4与羊8、羊10、羊12、羊14，羊3、羊11、羊13与羊7、羊8、羊12，羊5、羊9与羊6、羊7、羊8、羊12，羊6与羊8、羊9、羊10、羊12、羊14，羊7与羊8、羊9、羊10、羊11、羊12、羊13、羊14，羊8、羊12与羊9、羊11、羊13、羊14，羊12与羊14，均差异极显著。原精活力中，羊7与羊13差异显著。而冻后活力差异不显著。

表2 阿旺绵羊个体原精和冻精质量情况(14只)

3 讨论

国外对于绵羊精液冷冻保存技术研究始于20世纪50年代，我国绵羊冷冻精液技术研究始于1974年(金森等，2008；金美林等，2017)，而阿旺绵羊至今未见有进行冷冻精液制作研究的报道。通过此次研究，发现阿旺绵羊野性很强，不易与人接近，采精调教尤为困难，与池胜刚等(2013)的研究结果相似，这与其终年放牧的饲养方式有直接关系。通过采精操作者与公羊多接触、台羊性吸引、能采公羊相伴训练等办法，最终能够成功训练阿旺绵羊完成人工采集精液。而且，阿旺绵羊原精和冻精的品质显著高于《羊冷冻精液生产技术规程》中的相关要求，这说明能够常规开展西藏阿旺绵羊冷冻精液的生产，为阿旺绵羊种质资源保护和优秀雄性阿旺绵羊广泛应用提供了技术基础。在实际生产中发现，阿旺绵羊的原精活力非常好，训练采集至今尚未发现因原精活力而废弃的精液，个别羊只精液冻后活力偶尔因为活力低于标准而废弃。另外，在阿旺绵羊原精质量检测中，阿旺绵羊个体射精量之间存在不同程度的差异性，而精液密度差异极显著。这表明，阿旺绵羊个体之间原精品质在每次射精量与精子密度方面具有显著差别,而在原精活力和解冻后活力则无显著的差异。但在解冻后并进行配种后的受孕方面还为进行相关试验，这将是冷冻精液后续应用中另外的问题。