BA-ELISA法对食品中克百威残留的高效测定

朱文博，赵凌燕，王敏思，宋 洋

（天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

克百威（carbofuran）属于氨基甲酸酯类杀菌剂，具有高效、低残留的特点以及内吸、触杀、胃毒等一定的杀卵作用，可防治多种害虫、螨类和线虫，还可通过缩短作物生长期来提高作物产量，因此以往被广泛应用于农业生产领域[1].近年来克百威被限制使用：一方面，由于克百威的持效期和半衰期较长，因此易造成环境污染；另一方面，克百威会使胆碱酯酶失活，造成机体组织中乙酰胆碱大量蓄积从而导致中毒[2].我国《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2016）[3]中规定了克百威的残留限量标准，其中水果的最大残留限量（MRL）不得超过0.02 mg/kg.欧盟规定苹果和柑橘类水果中克百威的MRL分别为0.001和0.01 mg/kg[4].但目前仍有生产者将克百威作为隐性成分非法添加到农药产品中，导致农产品中的克百威超标，严重危害农产品质量安全.

现今常用的克百威残留分析方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱串联质谱法（GC-MS/MS）、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）及酶联免疫法（ELISA）等.仪器方法虽然可以准确测定多种药物，但繁琐费时，需要复杂的样品前处理过程、昂贵的仪器设备和专业的操作人员，检测成本高，难以满足现场快速检测样品的需要.酶联免疫吸附测定法由于具有特异性强、检测成本低等优势，适用于复杂体系基质中痕量组分的分离或检测，已成为许多国家检测农药残留的首选方法.近年来，已有一些针对果汁、茶叶、水果等农产品中克百威残留快速检测研究的报道，如Mickova等[5]基于单克隆抗体建立了酶联免疫吸附法和液相色谱-电喷雾质谱（HPLC/ESI/MS/MS）法，测定婴儿水果食品中的克百威、西维因和甲硫威，ELISA中克百威的方法检测限（LOD）为0.3 μg/kg，样品的添加回收率为60%～100%，检测时间在4 h以内；何方洋等[6]基于筛选的克百威单克隆抗体，建立了间接竞争ELISA方法检测蔬菜及茶叶中的克百威残留，检测限分别为10 μg/L和5 μg/L，半抑制质量浓度（IC50）为2.3 μg/L，加标回收率为79.2%～102.7%，检测时间仅为1.5 h；Lan等[7]基于广谱特异性单克隆抗体建立了可同时检测水果和蔬菜中克百威与3-羟基克百威的间接竞争酶联免疫吸附测定法，检测限为0.03 μg/L，IC50为0.76 μg/L，检测时间约为2.5 h，相较于其他方法，该方法检测限更低，能更好地满足实验室食品样品中克百威含量的检测要求.

为了获得更为简单、快速、高效、灵敏的检测方法，本研究基于单克隆抗体建立了间接竞争生物素/亲和素酶联免疫分析方法（biotin/avidin-enzyme-linked immunosorbent assay，BA-ELISA），消除食品样品中基质的影响并且对前处理方法进行优化，使其更加简单、快捷、准确，从而实现水果及水果制品中克百威残留的高效检测.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：全波长酶标仪（Labsystems），美国雷勃公司；96孔酶标板，丹麦Nunc公司.

试剂：克百威、克百威抗原、单克隆抗体，山东华阳农药化工集团有限公司；辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（SA-HRP）、生物素化羊抗兔IgG（B-Ab2）、过氧化氢脲、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB），美国Sigma公司.

1.2 间接竞争BA-ELISA方法

向酶标板反应孔中加入100 μL经包被液（pH值为9.6的碳酸钠缓冲液）适当稀释的抗原，室温下包被过夜（或37℃包被3 h）.弃去孔内溶液，利用洗液（1 L PBS+0.5 g吐温）洗板3次，加入200 μL封闭液（含0.5%脱脂奶粉的PBS），室温下封闭1 h，弃封闭液，洗板3次，加入待测样（或梯度稀释的标样）和抗体各100 μL，同时设置空白组（不加标样或待测样以及抗体）和对照组（不加标样或待测样），37℃孵育20 min，洗板4次.每孔加100 μL稀释后的IgG（B-Ab2），37℃孵育20min，洗板4次.每孔加100 μL稀释后的SA-HRP，37℃孵育10 min，洗板5次.每孔中加150 μL现配制的底物，显色20 min，利用酶标仪读取A450和A650.

将包被原稀释，使每孔中的质量分别为0.1、0.5和1.0 μg.用离子浓度分别为10、20、30 mmol/L，pH值分别为5.5、6.5、7.4、8.5的磷酸钠缓冲液稀释生物素化羊抗兔抗体、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素及克百威标准品，孵育时间分别设为30、45、60 min，利用酶标仪读取A450和A650，计算IC50以确定最佳条件.

配制含量分别为0.05、0.15、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和8.00 μg/L的克百威标准品溶液，用BA-ELISA对其进行测定.以克百威标准品含量（μg/L）为横坐标，以抑制率（%）为纵坐标，绘制标准曲线.

式中：A空白为空白孔的吸光度；A对照和Ax为含量分别为0和x时克百威标准品的吸光度.

1.3 抗体特异性评价

以交叉反应率（CR）作为评判抗体特异性的标准[8].

式中：IC50(克百威)为克百威抑制率为50%时对应的克百威含量；IC50(其他标准品)为其他标准品的抑制率为50%时对应的标准品含量.

1.4 样品测定

1.4.1 样品处理

选用苹果、苹果汁、橙子、橙汁作为样品来评估间接竞争BA-ELISA法的性能和指标，水果及水果制品均来自于市售.

水果样品：称取2.0 g粉碎后的样品，向其中加入4 mL乙腈和1 g氯化钠，涡旋振荡2 min，离心5 min（4 000 r/min），吸取2 mL上清液进行旋蒸，加入1 mL甲醇复溶，置于4℃下储存备用.

果汁样品：取2 mL样品，加入4 mL乙腈和1 g氯化钠，涡旋振荡5 min，离心5 min（4 000 r/min），吸取2 mL上清液进行旋蒸，加入1 mL甲醇复溶，置于4℃下储存备用.

1.4.2 消除基质影响

为了减少基质的影响，将处理好的样品提取液分别用添加了鱼皮胶（FG）、牛血清蛋白和表面活性剂等基质掩蔽剂的PBS稀释液进行处理，再采用BA-ELISA法进行测定[9].

1.4.3 添加回收实验

本研究通过对苹果、苹果汁、橙子、橙汁4种样品进行加标回收实验来评价BA-ELISA方法的准确度.样品提取液分别添加不同质量的克百威标准溶液，使其终含量分别为10、20和40 μg/kg（每个含量重复3次），进行BA-ELISA实验并计算回收率.

1.4.4 盲样检测

取4种水果及其制品共12件空白样品，编号1#～12#，随机添加克百威标准品制成盲样用于BA-ELISA和气相色谱法（GC）检测.

1.4.5 方法比对实验

检测方法参考文献[10]，样品提取方法同1.4.1，处理后的样品提取液过0.22 μm有机滤膜，之后用气相色谱法进行检测.

2 结果与分析

2.1 BA-ELISA方法的建立

对抗原包被量、PBS缓冲液的浓度和pH值、稀释倍数、孵育时间等条件进行优化，确定最佳反应条件为：包被原的包被量为每孔0.5 μg，缓冲液浓度为10 mmol/L、pH值为7.4，IgG（B-Ab2）和SA-HRP均稀释5 000倍，IgG（B-Ab2）孵育时间为20 min，SA-HRP孵育时间为10 min.绘制的标准曲线如图1所示.由标准曲线计算可得，IC15=（0.082±0.002）μg/L，IC50=（0.265±0.010）μg/L，线性范围为0.12～2.10 μg/L.通过该方法得到的克百威检出限远低于我国及一些欧盟国家所规定的MRL值.

图1 克百威抑制曲线Fig.1 Carbofuran inhibition curve

2.2 特异性评价

选择与克百威结构类似的其他化合物进行交叉反应率测试，从而对抗体特异性进行评价，结果如表1所示.

表1 各化合物与抗体的IC50和CR值Tab.1 IC50 and CR of some compounds with antibody

由表1可以看出，同属于氨基甲酸酯类杀菌剂的异丙威、速灭威、灭多威和甲萘威的交叉反应率均低于0.01%，说明实验中的抗体具有很好的特异性，能够专一性检测克百威.抗体与丁硫克百威的交叉反应率为0.02%，可能是由于丁硫克百威容易降解为克百威，因此对抗体有一定的亲和性.

2.3 克百威BA-ELISA的校正曲线及基质曲线

经过优化，最终确定使用0.5%的FG-PBS缓冲液对处理后的水果及果汁样品提取液稀释20倍，采用BA-ELISA方法进行测定，所得抑制率曲线即为样品的基质曲线，如图2所示.

图2 克百威BA-ELISA标准曲线Fig.2 BA-ELISA calibration curve of Carbofuran

由图2可以看出，4种样品的基质曲线及吸光值曲线基本上能和标准曲线重合，说明该样品前处理方法能够基本消除基质影响.

2.4 添加回收实验

分别在苹果、苹果汁、橙子、橙汁的20倍稀释样品提取液中添加克百威标品，使其最终含量分别为10.00、20.00和40.00 μg/kg，每组设置3个平行，分别采用BA-ELISA方法和GC方法进行检测，通过计算OD值得到回收率，结果如表2所示.

表2 克百威在4种样品中的添加回收率Tab.2 Recovery of Carbofuran in four kinds of samples

由表2可知，4种样品采用BA-ELISA方法得到的克百威添加回收率为90.20%～99.83%，变异系数（CV）为1.8%～6.3%，同GC方法得到的结果基本一致.

2.5 盲样检测结果

将苹果、苹果汁、橙子、橙汁4种水果及其制品共12件空白样品编号为1#～12#，随机添加克百威标准品制成盲样，采用本研究建立的间接竞争BA-ELISA法检测克百威含量，以GC法检测结果作为对照，如表3所示.由表3可知，最终检测出阳性样品共5件，其中苹果2件、苹果汁1件、橙子2件，其检测结果与GC方法检测结果基本一致.

表3 分别采用BA-ELISA和GC方法得到的盲样中克百威的含量Tab.3 Carbofuran content in blind samples detected by BA-ELISA and GC method respectively

3 结论

本研究基于克百威单克隆抗体建立了简单、高效、灵敏的BA-ELISA方法，可用来检测水果及其制品中的克百威残留.样品仅需经过乙腈提取，提取液用0.5%的FG-PBS稀释20倍即可基本消除基质影响.采用BA-ELISA方法对样品进行检测，检测时间只需1 h，实现了对克百威残留的快速、高效检测.本实验所建立的BA-ELISA方法检测限为（0.082±0.002）μg/L，灵敏度为（0.265±0.010）μg/L，水果及其制品的最低检出限是0.25 μg/kg，远低于我国及一些欧盟国家所规定的MRL（0.02 mg/kg）的标准.以GC方法作为对照，BA-ELISA方法对水果及其制品中克百威含量的检测结果与其基本一致，证实该方法准确可靠.与常用方法相比，BA-ELISA法所需时间更短，检出限更低，可作为一种高效灵敏准确的水果及其制品中克百威残留的检测手段.