丁香酚包合物对心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏的保护作用及机制研究＊

韩运祺，王 娜，石佳琦，李文妍，肖云峰，3＊＊

（1.内蒙古医科大学药学院 呼和浩特 010110；2.内蒙古自治区人民医院药学处 呼和浩特 010110；3.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心 呼和浩特 010110）

心脏疾病目前是对人类生命和健康构成威胁的最常见疾病之一，也是大多数人的主要死亡原因之一[1]。冠心病的病理基础是冠状动脉狭窄或阻塞，导致心肌缺血或坏死。临床治疗心肌缺血的主要策略是缓解心绞痛症状，恢复冠状动脉血流。然而，再灌注治疗可导致显著的心肌损伤，这种现象称心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）[2]。

目前，对MIRI的发病机制认为与细胞凋亡、心肌能量代谢障碍、氧自由基爆发、细胞内钙超载等有关[3-5]。然而研究表明，心肌能量代谢障碍又被认为是心肌缺血再灌注损伤的始发环节[6]，能量代谢也作为心肌细胞活动的重要参与者[7]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）作为调节能量代谢的核心分子，不仅能够调节心脏功能，而且可以影响细胞能量代谢和细胞器功能[8]。AMPK参与了体内多种代谢过程的调节[9]。因此，通过调控信号通路来避免心肌细胞凋亡已被证明是有效的MIRI治疗策略[10]。

丁香酚是从丁香或其它含丁香酚芳香油的植物中分离得到的淡黄色稠性油状液体。现代实验结果显示，丁香酚具有多种药理活性主要包括解热镇痛、抗炎抗氧化、麻醉、改善学习记忆和神经保互等作用[11]。丁香酚保护心脏的作用被广泛报道，但具体机制并未见详细阐述。马强等[12]报道指出丁香酚对H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响中表明丁香酚可调节氧自由基的清除能力和脂质过氧化反应，从而增加SOD活力和减少MDA的产生以及LDH的释放，从而明显增加受损心肌细胞的存活率，减少细胞凋亡，但是其机制尚未阐述。因此，本研究以丁香酚包合物为研究对象，利用手术法建立MIRI模型，并基于AMPK能量代谢信号通路，探究丁香酚对MIRI大鼠心肌保护作用的机制，为丁香酚的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和主要仪器

丁香酚Eugenol（罗恩试剂，质量分数≥99%，批号：RH206547）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）（国药集团化学试剂有限公司，批号为20150026）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号为20181217）；SOD、MDA测试盒（南京建成科技有限公司，批号为20210624、20210624）；LDH、CK、CKMB、AST试剂盒（宁波美康生物科技股份有限公司，批号190318102，190420101，190418201，190328201）；β-环糊精（天津南开允公合成技术有限公司，批号：20201018）；丁香酚/β-环糊精包合物（内蒙古医科大学实验室自己制备，批号：20210824）;BCA蛋白质定量试剂盒（上海碧云天生物技术研究所，批号080719200403）；盐酸地尔硫䓬片（天津田边制药有限公司，批号：2007044）TTC染液（南京建成科技有限公司，批号：20200729）；β-肌动蛋白（β-actin美国CST公司,批号13E5）；山羊抗兔二抗（美国abbkine公司，批号ATTAP0801）；抗体AMPK、p-AMPK、GLUT4、cTn1（英国CST公司，批号分别为#2532，#2535，#2213，#13083）；RIPA裂解液（索莱宝科技有限公司，批号20180913）；PMSF（上海碧云天生物技术研究所，批号112520210223）；台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司，型号3K15）；Thermo-KS12生物安全柜（美国Thermo Fisher公司）；小动物呼吸机（深圳市瑞沃德科技生命有限公司，型号RWD407）；金属浴（北京天根生化科技有限公司，型号OSE-DB-01）；组织研磨仪（北京天根生化科技有限公司，型号SN1002358）；电泳仪（美国Bio-Rad公司，型号Mini Trans-Blot）；Multiskan MK3全 自 动 酶 标 仪（美 国Thermo Fisher公司）；全自动生化分析仪（爱尔兰Sapphire公司，型号ADS600）；红外激光成像系统（美国LI-COR公司，型号ODYSSEY CLx）

1.2 丁香酚包合物的制备

精密称取10 g β-环糊精粉末于250 mL具塞广口瓶中，加入100 mL蒸馏水，水浴加热70℃直至完全溶解后溶液呈透明澄清，室温下降温，备用。将丁香酚标准品与无水乙醇按照（1:3）制备成丁香酚无水乙醇溶液充分溶解，备用。将冷却置室温的环糊精溶液置于25℃数显搅拌器上，滴加丁香酚无水乙醇溶液，边加边搅拌，滴加结束后置于超声仪器40 kHz超声45 min，取出置于4℃冰箱过夜。次日取出后抽滤，得到初始粉末，用适当蒸馏水洗涤抽滤，最后用石油醚溶液润洗抽滤，于真空干燥箱中，40℃烘干8 h，即得丁香酚/β-环糊精包合物，高效液相色谱法检测丁香酚包合物的含量为76.2%。

1.3 动物、分组和模型制备

清洁级雄性Wistar体重在200-220 g大鼠70只，购自内蒙古医科大学实验动物中心，动物生产许可证编号：SCXK（蒙）2020-0001。将70只大鼠随机为7组，假手术组、I/R组、包合物基质组、地尔硫䓬组和丁香酚包合物低剂量组（0.125 g/kg/天）、丁香酚包合物中剂量组（0.25 g/kg/天）、丁香酚包合物高剂量组（0.5 g/kg/天），每组10只。空白组与模型组灌胃给药CMCNa，包合物基质组灌胃给予环糊CMC-Na精混液，阳性药组灌胃给予地尔硫䓬CMC-Na混悬液，丁香酚包合物低、中、高剂量组分别按0.125 g/kg/天、0.25 g/kg/天、0.5 g/kg/天（含有实际丁香酚含量95 mg、190.5 mg、381 mg）灌胃给予丁香酚包合物混悬液。各组每天给药1次，连续给药15天，末次给药1 h后开始建立MIRI模型。手术法建立MIRI模型，将各组大鼠手术前12 h禁食不禁水。用碘伏进行常规消毒，备皮，连接心电图仪器，气管插管连接小动物呼吸机，频率为60次/min，在左侧心脏搏动处往左稍偏切开一2 cm的纵行切口，分离肌肉组织后剪断第3-4根肋骨，暴露心脏，在心脏冠状动脉左前降支，用7-0号线结扎左冠状动脉的前降支30 min，然后恢复再灌注24 h从内向外逐层缝合，并记录再灌注即刻心电图。再灌注24 h后取材心脏，记录再灌注24 h后心电图。假手术组开胸后，在冠脉左前降支处仅穿线不结扎。

1.4 全自动生化分析仪法检测大鼠血清中LDH、CK、CK-MB、AST含量

建模成功后，再灌注24 h，各组大鼠腹主动脉取血，采血管静置30 min。离心机参数设置为3500 r·min-1，离心10 min吸取血清。采用全自动生化分析仪检测LDH、CK、CK-MB、AST的活力。

1.5 TBA、WST-1法检测心肌组织中MDA、SOD含量

再灌注24 h后，手术取出的心脏组织迅速置于预冷的生理盐水中，清洗组织血迹。心肌组织按质量体积比1:9加生理盐水剪碎，在低温研磨，离心机以3000 r·min-1，离心10 min，取上清即得匀浆液。BCA检测各组样品蛋白浓度。之后按照相关试剂盒操作说明书酶标仪测定心肌组织中SOD、MDA的活力。

1.6 采用Western blotting法检测大鼠心肌组织中p-AMPK/AMPK、GLUT4、cTn1蛋白表达水平

Western blotting检测AMPK信号通路相关基因（AMPK、p-AMPK）和心肌相关基因（cTn1）的表达。将建模成功后，取缺血的心脏组织置于预冷的生理盐水中进行清洗，待组织清洗置无血迹，滤纸吸去附着于组织上的生理盐水，将组织剪成1-3 mm的碎块。称量组织，按组织：裂解液=1:10使用低温组织研磨仪器进行组织匀浆，充分研磨观察至无明显组织块，放置30 min，4℃离心，12000 rpm·min-1，10 min，吸取上清即得组织蛋白提取液，按照BCA试剂盒检测蛋白浓度，蛋白上样量为每孔20µg，与5×loading buffer缓冲液混合、上样、转置PVDF膜上、封闭液封闭，分别将转膜成功的PVDF膜放于p-AMPK/AMPK、GLUT4、cTn1一抗溶液中（一抗按照1:1000稀释），4℃孵育过夜，TBST洗膜10 min重复三次，放入荧光二抗中（二抗按照1:1000稀释）室温避光孵育1 h。TBST洗膜重复三次，TBS洗膜一次，每次10 min。置于红外成像系统扫描并采集条带照片，Image-J软件分析目标条带并获得灰度值，各组条带与β-actin的比值作为蛋白相对表达量。

1.7 采用TTC染色法检测MIRI大鼠心肌梗死面积

心肌缺血再灌注24 h之后，空白组、包合物基质组、阳性药对照组、丁香酚包合物低、中、高剂量组各组选两只建模成功的大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液（注射剂量为0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，麻醉后用手术剪慢慢地剪开大鼠的胸腔，剥离其心肌组织，用剪刀将心脏剪下并用0.9%氯化钠注射液冲洗干净，立刻置于-80℃冰箱中冷冻5 min，将冷冻后的心脏切成约1-2 mm的薄片，置于预热37℃的1%的TTC染液中，孵育15 min后，取出心脏用相机拍下并作相关记录，用IMAGE pro plus进行图像处理，分析并计算心肌梗死面积。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 心电信号检测结果

当心脏发生缺血时心电信号常伴有异常性特征，例如在ST段的形态变化，T波的幅值变化，心率及其变异性的变化等[13]。心电结果表明，大鼠进行心肌缺血再灌注手术后ST段明显抬高，显示大鼠心肌发生缺血损伤样改变，表明心肌缺血模型建立成功（图1）。

图1 大鼠造模不同时间点心电图变化

2.2 丁香酚包合物对MIRI大鼠血清中LDH、CK、CKMB、AST含量的影响

与假手术组比较，I/R组大鼠血清中LDH、CK、CK-MB、AST活力均有显著提高（P＜0.01）。与I/R组比较，各组丁香酚包合物血清中LDH、CK、CK-MB、AST活力呈剂量依赖性降低（P＜0.01）。包合物基质组对心肌四种酶水平没有影响（表1）。

表1 丁香酚包合物对心肌缺血再灌注损伤后LDH、CK、CK-MB和AST水平的影响（xˉ±s，n=8）

2.3 丁香酚包合物对MIRI大鼠心肌组织中MDA、SOD含量的检测

与假手术组比较，I/R组大鼠组织中心肌酶MDA活性升高（P＜0.01），SOD活性降低（P＜0.01）；与模型组比较，丁香酚包合物呈剂量依赖性的降低组织中MDA水平（P＜0.01），升高SOD水平（P＜0.01），阳性药组降低组织中MDA水平（P＜0.01），升高SOD水平（P＜0.01），包合物基质组对心肌二种酶水平没有影响，说明丁香酚包合物对心肌损伤具有保护作用（表2）。

表2 丁香酚包合物对心肌缺血再灌注损伤后MDA和SOD水平的影响

2.4 丁香酚包合物对MIRI大鼠心肌组织p-AMPK/AMPK、GLUT4、cTn1表达的影响

结果表明，与假手术组比较，模型组、包合物基质组心肌组织中P-AMPK/AMPK，表达水平均有显著上调（P＜0.01）。与模型组比较，不同浓度丁香酚包合物组心肌组织中P-AMPK/AMPK表达水平降低，其中以丁香酚包合物高剂量表达减少明显，其差异具有显著性（P＜0.01）。与假手术组比较，模型组、包合物基质组的cTn1的表达水平升高，其差异具有显著性（P＜0.01），表明心肌组织受到损伤，模型建立成功。与模型组相比，经不同浓度的丁香酚包合物预处理后的cTn1的表达降低（P＜0.01），且具有剂量依赖性；与假手术组相比，模型组、包合物基质组GLUT4蛋白表达明显减少，其差异具有显著性（P＜0.01），丁香酚包合物低、中、高剂量组GLUT4蛋白表达水平明显升高，其差异具有显著性（P＜0.01）。表明丁香酚能够对心肌缺血再灌注损伤具有与保护作用。实验结果见图2、表3。

图2 丁香酚包合物对MIRI大鼠心肌组织P-AMPK/AMPK、GLUT4和cTn1蛋白表达的影响

表3 丁香酚包合物对MIRI大鼠心肌组织P-AMPK/AMPK、GLUT4和cTn1蛋白表达的影响（xˉ±s，n=3）

2.5 丁香酚包合物对MIRI大鼠心肌梗死面积的影响

实验结果表明，与假手术组相比，模型组心肌出现梗死症状；与模型组相比，丁香酚包合物低、中、高剂量组出现的心肌梗死症状均有改善，其中丁香酚包合物高剂量组的心肌梗死面积与模型组相比差异明显（P＜0.01）；地尔硫䓬组可减少心肌缺血导致的心肌梗死面积。说明丁香酚包合物对心肌缺血再灌注所引起的心肌梗死症状有缓解作用，实验结果如图3。

3 讨论

大量数据表明心血管疾病已经成为危害人类生命健康、生活质量甚至死亡的主要原因之一，根据世界卫生组织发布的《2019全球健康预测》概要表明，心血管现患病人数以及死亡率居首位，占由疾病构成死亡人数的40%以上[14]。由于近年来对丁香酚药理作用的深入研究，其抗氧化作用受到重视。有研究表明，丁香酚可通过调节各项生化指标来缓解连二亚硫酸钠（Na2S2O4）导致的心肌细胞缺氧/复氧损伤模型[15]。因此本课题以心肌缺血再灌注为模型，探讨丁香酚对缺血、缺氧后能量代谢信号通路AMPK的影响。

图4 丁香酚包合物对大鼠心肌的TTC染色结果

丁香酚为天然的药物，作为挥发油类物质现多见于临床应用，但是由于丁香酚具有挥发性和不稳定性，不利于保存且对肠道存在刺激作用[16]。β-环糊精具有特殊的空间结构，常作为药用辅料使用，不仅可以提高药物生物利用度而且可掩盖丁香酚的不良气味[17]。所以本课题组将丁香酚制成β-环糊精包合物供体内实验使用不仅可减少丁香酚的肠道刺激作用而且将丁香酚液体药物固体化利于保存。Xiaowei Sun等人研究表明[18]，100 mg的丁香酚可缓解脑缺血再灌注损伤后P-mTOR/mTOR的表达，因此本研究以心肌缺血再灌注损伤为研究对象，探讨丁香酚对MIRI的作用是否与能量代谢通路AMPK有关，并以100 mg丁香酚作为研究剂量。本研究以地尔硫䓬作为阳性对照药是因为在前期研究中刘英[19]等人得出结论地尔硫䓬可通过减少炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的浸润起到心脏的保护作用，并且Chunxia Chen[20]等人研究证明地尔硫䓬可减少心肌梗死面积和心律失常，并降低氧化应激，衰减钙超载，降低了Bax蛋白的表达，并相应增加了Bcl-2与Bax的比率，抑制凋亡。本实验研究结果显示，通过结扎大鼠冠状动脉左前降支30 mim，再灌注24 h发现可使大鼠心电信号S-T段抬高，说明大鼠MIRI模型建立成功，但是结扎即刻时心电信号显示出不明显的P波和T波，得知P波是由心房除极化活动而产生，文中出现情况课题组考虑心房除极化活动产生P波，但是该P波与其前面发生的波形的位置发生重叠，因而导致P波消失。以往的研究中发现临床上心肌缺血是一个发展较慢的过程而ST-T段的变化T波由直立至倒置、ST段由平直延伸至ST段压低，易与非冠脉病的ST-T改变混淆在一起[21]。模型建立成功后各给药组与MIRI模型组比较，丁香酚包合物低、中、高剂量组均能够不同程度降低大鼠血清中CK、CK-MB、LDH和AST的活力，并且呈剂量依赖性。SOD是体内氧自由基清除系统的主要酶，MDA作为反应自由基对机体损伤程度的重要指标也在缺氧复氧时起到重要作用[22]。本研究结果表明，不同浓度的丁香酚包合物可减少MIRI大鼠心肌组织中MDA的水平，提高SOD水平。因此证明，丁香酚包合物对MIRI起到保护作用。

辛铭秀[23],研究结果显示，心肌细胞的缺氧/复氧损伤可通过调节能量代谢通路AMPK来起到保护作用。当细胞或动物出现缺血或者缺氧时AMPK信号通路被高度激活，这表明AMPK信号通路对MIRI具有重要的意义[24-25]。AMPK作为能量代谢的重要信号通路，参与多种能量代谢调节的过程，相关研究显示，心肌缺血再灌注后处于应激状态的心肌细胞由于供氧的缺乏，使得ATP产成不足进而AMP含量增加，从而使AMPK被磷酸化激活[26]。被激活的AMPK（即p-AMPK）对下游多种底物产生作用，其中最主要包括抑制了ATP的消耗，并重新将ATP的产生途径激活以维持机体能量代谢平衡。PGC-1α作为调节抗氧化酶的活性的重要物质，不仅能减少MDA+及活性氧（ROS）的含量，而且还能发挥抗氧化应激作用，从而达到保护心肌缺血性损伤的作用[27-28]。然而被磷酸化活化的AMPK则可进一步影响下游PGC-1α的表达。心肌肌钙蛋白I，是心肌损伤的重要标示物，在血清中含量极少，但是在心肌梗死时含量明显升高[29]。另外本实验证明，与MIRI模型组相比，经过丁香酚包合物处理后P-AMPK/AMPK、cTn1蛋白表达水平明显上调，并且呈剂量依赖性。TTC染色显示心肌梗死面积减少。因此，体内实验结果表明，丁香酚包合物可减轻MIRI的作用与抑制磷酸化AMPK相关。

综上所述，本实验将挥发性、不稳定性药物丁香酚经过β-环糊精包合后增加药物稳定性，供体内实验使用。实验得出结论经过丁香酚包合物处理后大鼠MIRI得到缓解，其机制可能与有效抑制磷酸化的AMPK蛋白表达和心肌肌钙蛋白cTn1的表达有关。研究结果有望为丁香酚减轻MIRI的治疗及机制研究提供一定的实验数据。