三七皂苷R1上调miR-132对人下咽鳞癌FaDu细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用

2022-10-14高鑫樊新龙曾巍梁冀望郭囡杨骁赵月皎

山东医药 2022年28期

高鑫，樊新龙，曾巍，梁冀望，郭囡，杨骁，赵月皎

高鑫，樊新龙，曾巍，梁冀望，郭囡，杨骁，赵月皎

辽宁省肿瘤医院头颈外科，沈阳 110042

探讨三七皂苷R1（NGR1）对人下咽鳞癌FaDu细胞中miR-132表达的影响及其抗肿瘤作用机制。以0、75、150、300 μmol/L NGR1处理FaDu细胞，并分别标记为Control组、75 μmol/L NGR1组、150 μmol/L NGR1组、300 μmol/L NGR1组。采用MTT法检测各组细胞增殖能力，Real-time PCR检测各组细胞miR-132相对表达量。再将FaDu细胞分为Control组（未处理）、NGR1组（给予150 μmol/L NGR1）、miR-132 inhibitor-NC组（转染miR-132 inhibitor-NC）、miR-132 inhibitor组（转染miR-132 inhibitor）、miR-132 inhibitor-NC+NGR1组（转染inhibitor-NC后，给予150 μmol/L NGR1处理）、miR-132 inhibitor+NGR1组（转染inhibitor后，给予150 μmol/L NGR1处理），通过MTT、划痕以及Transwell侵袭试验检测抑制或上调miR-132后对FaDu细胞增殖、迁移以及侵袭能力的影响。Control组、75 μmol/L NGR1组、150 μmol/L NGR1组、300 μmol/L NGR1组FaDu细胞增殖能力依次降低，细胞中miR-132的相对表达量依次升高，组间差异有统计学意义（均<0.05）。与Control组相比，miR-132 inhibitor组FaDu细胞活力、迁移侵袭能力增强，NGR1组FaDu细胞活力、迁移、侵袭能力减弱（均<0.05）。miR-132 inhibitor+NGR1组与NGR1组比较，FaDu细胞活力、迁移、侵袭能力增强（均<0.05）。NGR1可能通过上调miR-132表达，抑制FaDu细胞的增殖、迁移以及侵袭。

三七皂苷R1；FaDu细胞；miR-132；细胞增殖活力；迁移能力；侵袭能力

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其中的下咽鳞状细胞癌（HSCC）是HNSCC中病死率最高的一种，患者5年总体生存率仅为35 %［1］。三七皂苷R1（NGR1）是从五加科植物三七的根茎中提取的有效成分，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等特性［2］，对结直肠癌、肝癌等多种肿瘤的发生发展均具有较好的抑制作用。研究报道，NGR1通过抑制基质金属蛋白酶9的表达，从而抑制HCT-116细胞的迁移以及侵袭［3］。进一步研究证实，miR-132在多种癌症中低表达，且NGR1可以上调miR-132的表达，进而减轻LPS诱导的炎症损伤［4-5］。但NGR1的抗肿瘤作用是否通过调控miR-132表达来执行尚不清楚。2020年6月—9月，本研究对NGR1靶向miR-132抑制人下咽鳞癌FaDu细胞增殖、迁移、侵袭的作用及可能机制进行了探讨。

1 材料方法

1.1材料人下咽鳞癌FaDu细胞（本院实验室保存），DMEM培养基（Gibco，美国），三七皂苷R1（源叶生物，上海），MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（Wanleibio，沈阳），Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国），TRIpure、Super M-MLV反转录酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix、SYBR Green（BioTeke，北京），Transwell小室（Corning，美国），Matrigel胶（BD，美国），结晶紫（Amresco，美国）。

1.2方法

1.2.1FaDu细胞培养将FaDu细胞置于含10 %胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、5% CO2的培养箱内培养。

1.2.2不同浓度NGR1处理后细胞增殖能力检测将培养的FaDu细胞接种于96孔板中，每孔细胞量为5×103个。待细胞贴壁后，加入终浓度分别为0、75、150、300 μmol/L NGR1处理FaDu细胞，并分别标记为Control组、75 μmol/L NGR1组、150 μmol/L NGR1组、300 μmol/L NGR1组，每组设5个平行孔。于培养箱内孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT染色液，在细胞培养箱内继续孵育。4 h后吸去上清，加入150 μL Formanzan溶解液，至Formanzan完全溶解后在酶标仪上测定其在570 nm波长处OD值，观察FaDu细胞不同浓度NGR1处理后的增殖情况。

1.2.3不同浓度NGR1处理后细胞miR-132相对表达量检测经0、75、150、300 μmol/L NGR1处理24 h后，收集FaDu细胞，用TRIzol法提取细胞总RNA，使用紫外分光光度计测定各样本中RNA纯度以及浓度。将上述的总RNA样本按试剂盒说明书进行反转录，得到对应cDNA样本。以1 μL cDNA、0.5 μL浓度为10 μmol/L的正反向引物、10 μL SYBR GREEN mastermix和8 μL ddH2O配成反应体系进行PCR扩增：94 ℃预变性5 min，1个循环；95 ℃变性15 s、58 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸30 s，40个循环，以U6为内参，检测不同浓度NGR1处理下FaDu细胞中miR-132的相对表达量，检测结果经2-ΔΔCt处理。miR-132正向引物：TAACAGTCTACAGCCATGGTCG；反向引物：5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。 U6正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACT-3'；反向引物：5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。

1.2.4抑制或上调miR-132后细胞活力检测取对数生长期的FaDu细胞，将细胞接种至6孔板，于培养箱中过夜。待细胞密度达70 %以上时，开始进行转染。将细胞分为Control组（未处理）、NGR1组（给予150 μmol/L NGR1）、miR-132 inhibitor-NC组（转染miR-132 inhibitor-NC）、miR-132 inhibitor组（转染miR-132 inhibitor）、miR-132 inhibitor-NC+NGR1组（转染inhibitor-NC后，给予150 μmol/L NGR1处理）、miR-132 inhibitor+NGR1组（转染inhibitor后，给予150 μmol/L NGR1处理）。根据Lipofectamine 2000说明书将miR-132 inhibitor-NC以及miR-132 inhibitor转染至FaDu细胞中。待转染细胞24 h后，加入150 μmol/L NGR1处理，并设置相应对照组。MTT法检测各组细胞活力。

1.2.5抑制或上调miR-132后细胞迁移能力检测以适当密度将FaDu细胞接种至6孔板后，参照1.2.4中方法处理细胞，各组处理后将细胞培养基更换为无血清培养基并加入1 μg/mL的丝裂霉素C处理1 h。利用200 μL pipette tip造成细胞划痕，用无血清培养基清洗细胞表面1次，除去细胞碎片，显微镜下（100×）观察并按组拍照，记下照片中细胞的位置。将各组细胞置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，24 h后进行拍照记录，计算各组细胞迁移率。

1.2.6抑制或上调miR-132后细胞侵袭能力检测所有试剂以及器材在冰上预冷，将Transwell小室置于24孔板内，用预先稀释好的Matrigel胶包被小室，在37 ℃培养箱放置2 h使胶凝固。以适当密度将对数生长期FaDu细胞接种至6孔板后，参照1.2.4中方法处理细胞，收集各组处理后的细胞，以无血清培养基将其稀释成细胞悬液备用；向下室加入800 μL含10 % FBS的培养液，上室加入1×104个/孔的细胞悬液，体积为200 μL，每组设置5个复孔。将24孔板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养24 h。4 %多聚甲醛固定25 min，0.4 %结晶紫染色5 min，蒸馏水冲洗。倒置显微镜（200×）下拍照，并对侵袭至微孔膜下层的细胞计数，每个样本选取5个视野计数细胞个数。

2 结果

2.1NGR1对FaDu细胞增殖的影响处理24 h后，Control组、75 μmol/L NGR1组、150 μmol/L NGR1组、300 μmol/L NGR1组FaDu细胞增殖能力OD值分别为0.513 ± 0.057、0.436 ± 0.060、0.386 ± 0.043、0.270 ± 0.027，细胞增殖能力依次降低，组间差异有统计学意义（均<0.05）。150 μmol/L NGR1组、300 μmol/L NGR1组均低于Control组（均<0.05）。

2.2NGR1对FaDu细胞中miR-132表达的影响处理24 h后，Control组、75 μmol/L NGR1组、150 μmol/L NGR1组、300 μmol/L NGR1组FaDu细胞中miR-132、相对表达量分别为1.00 ± 0.10、1.63 ± 0.14、2.11 ± 0.09、3.07 ± 0.10，各组FaDu细胞中miR-132的相对表达量统计学差异有统计学意义（<0.05）；75 μmol/L NGR1组、150 μmol/L NGR1组、300 μmol/L NGR1组与Control组相比，miR-132的表达水平升高（<0.05）。本研究后续实验采用150 μmol/L NGR1处理细胞。

2.3抑制或上调miR-132对FaDu细胞增殖的影响处理FaDu细胞24 h后， Control组、NGR1组、miR-132 inhibitor-NC组、miR-132 inhibitor组、miR-132 inhibitor-NC+NGR1组、miR-132 inhibitor+NGR1组细胞增殖活力OD值分别为0.766 ± 0.073、0.470 ± 0.056、0.760 ± 0.110、1.008 ± 0.097、0.463 ± 0.075、0.723 ± 0.079；与Control组相比，miR-132 inhibitor组FaDu细胞活力增强，NGR1组FaDu细胞活力减弱，差异均有统计学意义（均<0.05）。miR-132 inhibitor+NGR1组与NGR1组比较，FaDu细胞活力增强（<0.05）。NGR1和miR-132 inhibitor共同处理细胞时，miR-132 inhibitor能够明显逆转NGR1对FaDu细胞增殖的抑制。

2.4抑制或上调miR-132对FaDu细胞迁移和侵袭的影响与Control组相比，miR-132 inhibitor组FaDu细胞迁移、侵袭能力增强，NGR1组FaDu细胞迁移、侵袭能力减弱，差异均有统计学意义（均<0.05）。miR-132 inhibitor+NGR1组与NGR1组比较，FaDu细胞迁移、侵袭能力增强（均<0.05）。转染miR-132 inhibitor后，NGR1对FaDu细胞迁移和侵袭的抑制作用受到逆转。见表1。

表1　抑制或上调miR-132对FaDu细胞迁移和侵袭的影响（± s）

注：与Control组相比，*<0.05；与NGR1组相比，**<0.05。

3 讨论

HSCC在头颈部恶性肿瘤中约占5%，是一种高侵袭性恶性肿瘤。尽管目前在HSCC的治疗方面取得了一些进展，但由于局部复发，远端浸润以及耐药性的产生等，HSCC患者预后仍不理想。因此，如何安全有效地防治肿瘤细胞的转移对改善HSCC患者预后尤为重要［6］。由于中药具有不良反应少、效率高和价格低等优势，其抗肿瘤作用逐渐成为目前的研究热点。已有研究证实，NGR1对心肌、中枢神经系统缺血损伤具有保护作用，并且在结直肠癌、肝癌中显示具有抗肿瘤细胞转移的作用［7］。但NGR1对HSCC细胞的增殖、侵袭是否同样具有抑制作用，目前还尚未有研究报道。本研究结果显示，NGR1能显著抑制FaDu细胞的增殖、迁移以及侵袭能力，但NGR1发挥抗肿瘤效应的具体调控机制还有待进一步明确。

大量研究显示，miRNA与HSCC的发生发展密切相关，在肿瘤细胞的增殖、迁移以及侵袭等生物学过程中发挥着重要的调控作用。KIKKAWA等［8］研究发现，抑癌基因miR-489靶向PTPN11可抑制HSCC的增殖；ZHOU等［9］研究显示，miR-204与HSCC患者的不良预后有关，且过表达miR-204能够抑制肿瘤细胞的迁移以及侵袭。越来越多的研究发现，miR-132在多种肿瘤中发挥着抑癌作用。miR-132通过阻断USP9X诱导的上皮间质转化而抑制肺癌细胞的迁移以及侵袭［10］； miR-132通过靶向E2F5抑制卵巢癌细胞的增殖以及侵袭［11］；miR-132在头颈部恶性肿瘤中存在差异表达［12］。SUN等［5］研究表明，NGR1能上调PC12细胞中miR-132的表达。我们研究显示，NGR1对FaDu细胞增殖能力有抑制作用；随着NGR1浓度升高，FaDu细胞增殖能力依次降低。通过检测NGR1处理后FaDu细胞中miR-132表达发现，NGR1能上调miR-132在FaDu细胞中的表达；以上结果提示NGR1可能通过上调miR-132参与HSCC癌细胞转移的调控过程。为了进一步验证miR-132是否在NGR1抑制FaDu细胞的增殖、迁移以及侵袭等过程中发挥关键作用，我们用miR-132 inhibitor转染FaDu细胞，并检测NGR1处理后细胞的增殖、迁移以及侵袭能力是否发生变化。结果显示，抑制miR-132能够逆转NGR1对FaDu细胞增殖、迁移以及侵袭能力的抑制。因此，我们认为NGR1对HSCC发挥抗肿瘤效应的机制与其上调FaDu细胞miR-132表达有关。

综上所述，NGR1对人下咽鳞癌FaDu细胞的增殖、迁移以及侵袭有抑制作用；人下咽鳞癌FaDu细胞miR-132的表达下调；NGR1通过上调FaDu细胞miR-132的表达，发挥抑制FaDu细胞侵袭和转移的作用。本研究为阐明NGR1抑制肿瘤细胞侵袭转移的分子机制提供了新的证据，也为HSCC的临床治疗提供了新的方法及思路。

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NGR1 inhibits proliferation， migration， and invasion of FaDu cells through up-regulating miR-132 expression

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，，110042，

To investigate the effect of notoginseng saponin R1 （NGR1） on the expression of miR-132 in human hypopharyngeal squamous cell carcinoma cell line FaDu， and to explore its possible anti-tumor mechanism.FaDu cells were treated with 0， 75， 150 and 300 μmol/L NGR1， and were labeled as the Control group， 75 μmol/L NGR1 group， 150 μmol/L NGR1 group and 300 μmol/L NGR1 group， respectively. The proliferation ability of cells in each group was detected by MTT assay， and the relative expression of miR-132 in each group was detected by real-time PCR. FaDu cells were further divided into the Control group （no treatment）， NGR1 group （given 150 μmol/L NGR1）， miR-132 inhibitor-NC group （transfected with miR-132 inhibitor-NC）， miR-132 inhibitor group （transfected with miR-132 inhibitor）， miR-132 inhibitor-NC+NGR1 group （150 μmol/L NGR1 treatment after transfection with inhibitor-NC）， and miR-132 inhibitor+NGR1 group （150 μmol/L NGR1 treatment after transfection with inhibitor）， respectively. MTT， Scratch and Transwell invasion assays were used to detect the effects of inhibition or up-regulation of miR-132 on the proliferation， migration and invasion abilities of FaDu cells.The proliferation abilities of FaDu cells in the Control group， 75 μmol/L NGR1 group， 150 μmol/L NGR1 group and 300 μmol/L NGR1 group decreased successively， and the relative expression of miR-132 in FaDu cells increased successively， and the differences were statistically significant （all<0.05）. Compared with Control group， the viability， migration and invasion abilities of FaDu cells in the miR-132 inhibitor group were enhanced， and the viability， migration and invasion abilities of FaDu cells in the NGR1 group were weakened （all<0.05）. Compared with the NGR1 group， the viability， migration and invasion of FaDu cells in miR-132 inhibitor+NGR1 group significantly increased （all<0.05）.NGR1 may inhibit the proliferation， migration and invasion of FaDu cells by up-regulating the expression of miR-132.

notoginseng saponin R1； FaDu cells； miR-132； cell proliferation activity； migration ability； invasive ability

10.3969/j.issn.1002-266X.2022.28.011