lncRNA LINC00174对骨肉瘤细胞恶性生物学行为的影响及其机制

2022-10-14刘行李磊

山东医药 2022年28期

刘行，李磊

刘行，李磊

恩施土家族苗族自治州中心医院关节外科诊疗中心，湖北恩施 445000

探讨长链非编码RNA（lncRNA） LINC00174对骨肉瘤细胞恶性生物学行为的影响及其机制。体外培养骨肉瘤SaOS-2细胞，随机分为Control组、si-NC组、si-LINC00174组，si-NC组、si-LINC00174组分别转染si-NC、si-LINC00174，Control组不予转染，转染6 h更换完全培养基，继续培养24 h。收集各组细胞，采用RT-qPCR法检测lncRNA LINC00174相对表达量，采用CCK-8法检测细胞增殖能力，采用Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移能力，采用Western blotting法检测上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达。利用生物信息学软件starBase预测lncRNA LINC00174与miR-206的靶向结合位点，并通过双荧光素酶报告基因实验验证。si-LINC00174组lncRNA LINC00174相对表达量显著低于Control组、si-NC组（均<0.05），而Control组与si-NC组比较>0.05。si-LINC00174组细胞存活率、细胞侵袭和迁移能力以及Vimentin、MMP-9、MMP-2相对表达量显著低于Control组、si-NC组，E-cadherin相对表达量显著高于Control组、si-NC组（均<0.05），而Control组与si-NC组比较均>0.05。经生物信息学软件预测和双荧光素酶报告基因实验验证，lncRNA LINC00174能够靶向调控miR-206。下调lncRNA LINC00174表达能够抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，其机制可能与靶向调控miR-206有关。

骨肉瘤；长链非编码RNA LINC00174；微小RNA-206；细胞增殖；细胞侵袭；细胞迁移

骨肉瘤是一种起源于间充质细胞的原发性恶性肿瘤，好发于青少年。骨肉瘤的侵袭性较高，大多数患者在确诊时已经发生远处转移，预后较差［1］。目前，骨肉瘤的发生机制尚不明确。因此，探索骨肉瘤发生的分子机制，寻找其早期诊断和靶向治疗的生物标志物具有重要意义［2］。长链非编码RNA（lncRNA）能够调控细胞生长、增殖和代谢等生物学过程，在人体多种疾病的发生中发挥重要作用，是近年来研究的热点［3-4］。LINC00174为lncRNA家族成员之一。有研究发现，在胶质瘤、肝癌细胞中lncRNA LINC00174高表达，下调lncRNA LINC00174表达可抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力［5-6］。但lncRNA LINC00174在骨肉瘤中的作用尚不清楚。前期预实验发现，lncRNA LINC00174与miR-206存在互补结合位点。miR-206是一个与肿瘤有关的小分子RNA，在骨肉瘤细胞中miR-206表达下调，而上调miR-206表达则可抑制骨肉瘤细胞的恶性表型［7］。由此推测，在骨肉瘤中lncRNA LINC00174可能通过靶向调控miR-206发挥作用。2020年10月—2022年3月，本研究探讨了lncRNA LINC00174对骨肉瘤细胞恶性生物学行为的影响及其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1材料人骨肉瘤SaOS-2细胞，购自上海奥陆生物科技有限公司。si-LINC00174、si-NC干扰序列，购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）抗体，购自美国Proteintech公司；波形蛋白（Vimentin）抗体，购自美国Sigma-Aldrich公司；基质金属蛋白酶9（MMP-9）抗体，购自北京义翘神州科技股份有限公司；基质金属蛋白酶2（MMP-2）抗体，购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；GAPDH抗体，购自美国Abcam公司。CCK-8试剂盒，购自日本同仁化学研究所；Transwell小室，购自美国Corning公司；miR-206 mimics、mimics control，购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2细胞转染将SaOS-2细胞接种于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。每2或3天更换1次培养基。待细胞生长融合达到80%时，按1∶4传代。取传4代、对数生长期、生长状态良好的SaOS-2细胞，以5×105个/孔接种于6孔板。随机将细胞分为Control组、si-NC组、si-LINC00174组，每组设6个复孔。然后将6孔板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养24 h，按Lipofectamine 2000说明，si-NC组、si-LINC00174组分别转染si-NC、si-LINC00174干扰序列，Control组不予转染仅加入转染试剂。转染6 h更换为完全培养基，继续培养24 h，收集细胞。采用TRIzol法抽提各组细胞总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格。按逆转录试剂盒说明，将总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：50 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min。以cDNA为模板，按PCR试剂盒说明进行扩增。引物序列：LINC00174上游引物5′-GGCCCAACACTTCCCTCAAA-3′，下游引物5′-CAGGGAGAAACGACCTGGAG-3′；GAPDH上游引物5′-GGTGGTCTCCCTCGACTTCAACAG-3′，下游引物5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。PCR反应体系共20 μL：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O补足至20 μL；反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算LINC00174相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3细胞增殖能力检测采用CCK-8法。将各组转染后SaOS-2细胞接种至96孔板，每孔3×103个细胞，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。分别于培养24、48、72 h，加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃避光孵育2 h。酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值，按公式计算各组细胞存活率。细胞存活率=（实验孔OD450值-空白孔OD450值）/（对照孔OD450值-空白孔OD450值）×100%。

1.4细胞侵袭和迁移能力检测采用Transwell小室实验。细胞侵袭能力检测时，将Matrigel基质胶于4 ℃下融化，取Matrigel基质胶50 μg与不含血清的细胞培养液95 μL混合，包被Transwell小室底部膜的上室面，37 ℃孵育1 h。将各组转染后SaOS-2细胞用不含血清的细胞培养液重悬，制成密度1×105个/mL的细胞悬液。取细胞悬液200 μL加入Transwell小室上室，下室加入含血清的细胞培养液600 μL。然后将Transwell小室置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。常规培养24 h后，取出Transwell小室，用棉签轻轻拭去上室面未穿膜细胞，95%甲醇固定20 min，0.25%结晶紫染色15 min，显微镜下随机选取5个200倍不重叠视野，计数穿膜细胞数。以穿膜细胞数代表细胞侵袭能力。细胞迁移能力检测时，Transwell小室底部膜的上室面不用Matrigel基质胶包被，其余步骤同细胞侵袭能力检测，以穿膜细胞数代表细胞迁移能力。

1.5E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-2表达检测采用Western blotting法。将各组转染后SaOS-2细胞加入RIPA裂解液提取细胞核蛋白，经BCA法蛋白定量合格后，加入等体积2×Loading Buffer混匀，100 ℃变性5 min。取变性蛋白30 μg，SDS-PAGE分离（10%分离胶、5%浓缩胶）。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-2、GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜。次日，加入HRP标记后的山羊抗鼠IgG二抗，室温孵育2 h。ECL显色，暗室内曝光、显影、定影。采用Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值，以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.6lncRNA LINC00174靶向调控miR-206预测与验证借助在线生物信息学软件starBase（https：//starbase.sysu.edu.cn/）预测lncRNA LINC00174与miR-206的靶向结合位点。根据突变位点设计lncRNA LINC00174野生型（WT）和突变型（MUT）质粒，按Lipofectamine 2000说明，将其分别同miR-206 mimics、mimics control共转染至SaOS-2细胞，将转染后SaOS-2细胞分为mimics control+lncRNA LINC00174 WT组、mimics control+lncRNA LINC00174 MUT组、miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 WT组和miR-206 mimics+LINC00174 MUT组。常规培养24 h，按双荧光素酶活性检测试剂盒说明检测各组荧光素酶活性。

2 结果

2.1三组lncRNA LINC00174表达比较Control组、si-NC组、si-LINC00174组lncRNA LINC00174相对表达量分别为1.00 ± 0.10、0.99 ± 0.12、0.45 ± 0.05。si-LINC00174组lncRNA LINC00174相对表达量显著低于Control组、si-NC组（均<0.05），而Control组与si-NC组比较>0.05。

2.2三组细胞增殖、侵袭和迁移能力比较见表1。

表1　三组细胞增殖、侵袭和迁移能力比较（± s）

注：与Control组比较，*<0.01；与si-NC组比较，#<0.01。

2.3三组E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-2表达比较见表2。

表2　三组E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-2相对表达量比较（± s）

注：与Control组比较，*<0.01；与si-NC组比较，#<0.01。

2.4lncRNA LINC00174和miR-206的靶向调控关系生物信息学软件预测显示，lncRNA LINC00174与miR-206存在靶向结合位点。mimics control+lncRNA LINC00174 WT组、mimics control+lncRNA LINC00174 MUT组、miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 WT组和miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 MUT组荧光素酶活性分别为1.00 ± 0.11、1.00 ± 0.08、0.35 ± 0.04、0.99 ± 0.11。miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 WT组荧光素酶活性显著低于mimics control+lncRNA LINC00174 WT组、mimics control+lncRNA LINC00174 MUT组、miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 MUT组（均<0.05）。

3 讨论

骨肉瘤是一种起源于间充质细胞的原发性恶性肿瘤，其病因和发病机制尚不明确，可能与遗传因素、病毒感染、辐射以及不良生活习惯等因素有关。骨肉瘤的侵袭性较高，早期即可发生远处转移，预后较差，也是导致治疗失败的重要原因。

lncRNA是一类无蛋白质编码作用的多功能调控因子，是近年来生物医疗领域研究的热点。在特定生理或病理条件下，lncRNA通过调控多种信号通路参与个体生长发育、疾病发生发展等生物学过程［8］。已有研究证实，肿瘤组织中存在多种lncRNA异常表达，并且其异常表达能够参与肿瘤细胞的恶性生物学行为。LINC00174为lncRNA家族成员之一。既往有研究报道，lncRNA LINC00174在肝癌组织中表达上调，而下调lncRNA LINC00174表达则抑制肝癌细胞侵袭和迁移［6］。在胶质瘤细胞中lncRNA LINC00174高表达，其高表达可促进肿瘤细胞增殖［5］。lncRNA在人体生理和病理活动中的作用极为广泛，并且在不同的生理和病理活动中作用不同。有研究报道，lncRNA可通过碱基互补的方式与miRNA结合而发挥作用，并且一种lncRNA可同时调控多个miRNA［9］。ZHAO等［10］研究发现，lncRNA LINC00174是肝细胞的致癌lncRNA，其表达上调能够加速肝癌细胞增殖、侵袭和迁移，并抑制其凋亡，从而发挥促癌作用。SHI等［11］研究指出，lncRNA LINC00174能够通过海绵化miR-1523-3p并增加SLC2A1表达，加速胶质瘤恶性转变，可作为胶质瘤诊断和治疗的分子靶点。但目前lncRNA LINC00174在骨肉瘤发生、发展中的作用尚不清楚。本研究结果显示，si-LINC00174组lncRNA LINC00174相对表达量显著低于Control组、si-NC组，而Control组与si-NC组比较差异无统计学意义；si-LINC00174组细胞存活率、细胞侵袭和迁移能力显著低于Control组、si-NC组，而Control组与si-NC组比较差异均无统计学意义。提示在骨肉瘤细胞中lncRNA LINC00174表达上调，而下调lncRNA LINC00174表达则可抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移。

肿瘤细胞的侵袭和迁移过程极为复杂，在发生侵袭和迁移之前会合成大量细胞外基质降解酶，这些细胞外基质降解酶能够降解细胞外基质，为肿瘤细胞的侵袭和迁移提供条件［12］。基质金属蛋白酶是主要的细胞外基质降解酶。MMP-2和MMP-9均属于基质金属蛋白酶家族成员，是调节细胞外基质降解的重要蛋白水解酶，可通过影响上皮间质转化促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移［13-14］。上皮间质转化是指间质细胞特性逐渐增加，而上皮细胞特性逐渐消失的过程。E-cadherin是上皮间质转化的重要标志蛋白之一，E-cadherin表达下调可导致细胞间黏附性降低，细胞由上皮样转化为间质样［15］。Vimentin是间质细胞标志蛋白，在肿瘤细胞上皮间质转化过程中表达上调，可参与肿瘤细胞的侵袭和迁移过程［16］。既往研究报道，上皮间质转化是肿瘤细胞发生侵袭和迁移的早期标志［17］。本研究结果显示，si-LINC00174组Vimentin、MMP-9、MMP-2相对表达量显著低于Control组、si-NC组，E-cadherin相对表达量显著高于Control组、si-NC组，而Control组与si-NC组比较差异均无统计学意义。提示下调lncRNA LINC00174表达能够通过抑制骨肉瘤细胞上皮间质转化而抑制肿瘤细胞恶性生物学行为。miR-206定位于人6号染色体，属于miR-1家族成员。有研究报道，在肺癌、肝癌等恶性肿瘤细胞中miR-206表达下调，上调miR-206表达则可抑制肿瘤细胞增殖［18］。WANG等［7］研究报道，上调miR-206表达可抑制circTCF25诱导的骨肉瘤细胞增殖和迁移。本研究生物信息学软件预测显示，lncRNA LINC00174与miR-206存在靶向结合位点；双荧光素酶报告基因实验发现，miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 WT组荧光素酶活性显著低于mimics control+lncRNA LINC00174 WT组、mimics control+lncRNA LINC00174 MUT组、miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 MUT组。结果提示，lncRNA LINC00174与miR-206存在靶向调控关系，lncRNA LINC00174可能通过靶向调控miR-206抑制骨肉瘤细胞的恶性生物学行为。

综上所述，下调lncRNA LINC00174表达能够抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与靶向调控miR-206有关。但lncRNA LINC00174靶向调控miR-206的具体机制尚不明确，仍需进一步研究。

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Effect and mechanism of lncRNA LINC00174 on malignant biological behavior of osteosarcoma

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，，445000，

To investigate the effect of long non-coding RNA （lncRNA） LINC00174 on the malignant biological behavior of osteosarcoma and its mechanism.Osteosarcoma SaOS-2 cells were cultured in vitro， and were randomly divided into the Control group， si-NC group， and si-LINC00174 group. The SaOS-2 cells in the si-NC group and si-LINC00174 group were transfected with si-NC and si-LINC00174， respectively， and the Control group was not transfected. The complete medium was replaced at 6 h after transfection， and the culture was continued for 24 h. The cells of each group were collected， and the relative expression of lncRNA LINC00174 was detected by RT-qPCR， the cell proliferation ability was detected by CCK-8， the cell migration and invasion abilities were detected by Transwell chamber assay， and the epithelial cadherin （E-cadherin）， Vimentin， matrix metalloproteinase 9 （MMP-9）， matrix metalloproteinase 2 （MMP-2） expression levels were detected by Western blotting. The bioinformatics software starBase predicted the targeted binding sites of lncRNA LINC00174 and miR-206， and they were verified by dual-luciferase reporter gene experiment.The relative expression level of lncRNA LINC00174 was significantly lower in the si-LINC00174 group than in the Control group and the si-NC group （both<0.05）， and no significant difference was found between the Control group and the si-NC group （>0.05）. The si-LINC00174 group had significantly lower cell viability， cell invasion and migration abilities， and the relative expression levels of Vimentin， MMP-9， and MMP-2 than the Control group and si-NC group， but the relative expression of E-cadherin was significantly higher than those of the Control group and the si-NC group （both<0.05）， while no significant difference was found between Control group and si-NC group （all>0.05）. Predicted by bioinformatics software and verified by dual-luciferase reporter gene experiment， lncRNA LINC00174 could target and regulate miR-206.Down-regulation of lncRNA LINC00174 expression can inhibit the proliferation， migration and invasion of osteosarcoma cells， and the mechanism may be related to the targeted regulation of miR-206.

osteosarcoma； long non-coding RNA LINC00174； microRNA-206； cell proliferation； cell invasion； cell migration

10.3969/j.issn.1002-266X.2022.28.010