基于网络药理学和分子对接探讨紫苏子治疗糖尿病心肌损伤的机制*

彭志坚 陈正涛 邓 斌 魏山寅 范治力 宋银枝△

糖尿病心肌损伤(Diabetic heart injury,DMI)是糖尿病主要并发症之一，有研究表明在排除了冠心病或风湿性心脏病病史后，糖尿病患者的心衰风险仍增加4～5倍，DMI已经成为糖尿病患者致死的重要原因之一[1]。《本经逢原》认为：“苏子性能下气，故胸膈不利者宜之”，现代药理学研究发现紫苏子提取物能增加糖尿病小鼠的胰岛素敏感性和减少氧化应激反应[2]，但紫苏子在治疗DMI的保护作用机制研究较少。网络药理学目前被广泛应用于预测单味中药或复方作用机制，其通过构建“成分-靶点-基因-疾病”的分子网络阐述中药生物学功能和作用机制的方法与中药及其复方的多成分、多靶点、多通路协同作用的特点相吻合。本文采用网络药理学与分子对接的方法对紫苏子治疗DMI的潜在机制及作用网络展开了研究。

1 材料与方法

1.1 紫苏子主要化学成分和靶点筛选通过TCMSP数据库以生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18作为ADME筛选条件收集紫苏子主要化学成分对应的靶点[3，4]，再经UniProt数据库转化为基因名。

1.2 疾病靶点的筛选将“Diabetic heart injury”及“Diabetes cardiomyopathy”作为关键词，从GeneCards数据库和OMIM数据库检索获得DMI相关的疾病靶点并删除重复基因。

1.3 活性成分-交集靶点网络图的构建及交集靶点靶蛋白相互作用(PPI)网络构建紫苏子和DMI相关靶点运用Venny 2.1.0获得交集靶点，利用Cytoscape 3.7.2软件绘制“活性成分-交集靶点”网络，借助STRING 11.0平台进行PPI网络的构建，限定物种为“Homo sapiens”，置信度为中置信度0.4，其余参数均为默认设置，得到下载tsv格式文件，将文件导入Cytoscape 3.7.2作图。应用软件中的cytoNCA插件对网络拓扑参数进行筛选，筛选出Degree值前9个的节点作为关键靶点。

1.4 GO与KEGG通路富集分析将交集靶点数据导入Metascape平台，设置P<0.01，分析紫苏子主要的生物学过程与代谢通路并进行富集分析，将数据运用微生信平台进行可视化处理。

1.5 分子对接将紫苏子核心成分与PPI网络中筛选出的9个核心蛋白进行分子对接。从TCMSP数据库下载紫苏子核心成分的MOL2格式文件，从蛋白质数据库获得9个核心蛋白的3D结构。利用AutoDockTools 1.5.6和PyMOL 2.3.4软件关键靶点蛋白质进行：去除水分子，分离配体和受体，加入极性氢，计算Gasteiger电荷，分配AD4类型，将小分子配体柔性键设置为可旋转等操作。对接过程使用AutoDock Vina 1.1.2执行，得到结合能数据，最后运用PyMOL 2.3.2软件展示结合活性最高的模型。

2 结果

2.1 紫苏子有效成分和靶点筛选根据1.1筛选条件共筛选出16个化合物，剔除预测不到靶点的化合物共得到14个有效成分。考虑到紫苏子主要成分为亚麻酸及亚油酸，其中亚麻酸含量高达50%～62%[5]，故将此二者也纳入，最终共筛选出有效成分16个。见表1。其主要活性成分对应的靶点经UniProt数据库转化为相应的基因ID名称，剔除重复靶点后共得到139个有效作用靶点。

表1 紫苏子活性成分表

2.2 与DMI相关疾病靶点筛选通过GeneCards数据库获得与DMI相关的疾病靶点并删除重复基因，共得7345个靶点，取两倍中位数后获得靶点2150个；通过OMIM数据库获得靶点584个。合并上述获得的疾病靶点，并再次剔除重复靶点，最终获得相关疾病靶点2579个。

2.3 活性成分交集靶点成分-靶点-疾病网络图的构建将与DMI相关的疾病靶点与紫苏子预测作用靶点取交集绘制韦恩图,得交集靶点105个(见图1)。利用Cytoscape 3.7.2软件绘制“活性成分-交集靶点”网络(见图2)，超过14个靶点的活性成分有木犀草素(Luteolin)、花生四烯酸(Arachidonic acid)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、亚麻酸(Linolenic acid)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-胡萝卜素(Beta-carotene)，这些成分可能是治疗糖尿病心肌损伤的主要有效成分。

图1 紫苏子-DMI交集靶点

图2 活性成分交集靶点网络图

2.4 靶蛋白相互作用(PPI)网络构建根据1.3所述方法构建PPI网络，共有105个节点，1500条边，应用软件中的cytoNCA插件对网络拓扑参数进行筛选，筛选出Degree值大于60的靶点作为核心靶点9个。见表2。

表2 紫苏子治疗DMI的核心靶点及degree值

2.5 交集靶点GO和KEGG富集分析将交集靶点进行GO和KEGG富集分析(见图3、图4)。结果显示，生物过程主要涉及细胞氮化合物反应、有毒物质反应、无机物反应、细胞成分运动的正调控、炎症反应等，细胞组成中主要影响膜筏、细胞质的核周区域、突触后膜、受体复合物、胞质泡膜等，分子功能主要包括蛋白质域特异性结合、蛋白质同源二聚活性、脂质结合、激酶结合、转录因子结合等方面。参与调控多个KEGG信号通路，主要有癌症通路、PI3K-Akt信号通路(见图5)、前列腺癌、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化、细胞凋亡、TNF信号通路、钙信号通路等。

图3 交集靶点GO富集分析条形图交集靶点GO富集分析条形图

图4 交集靶点KEGG富集分析气泡图

图5 PI3K-AKT信号通路图

2.6 分子对接将核心成分木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亚麻酸、豆甾醇与核心靶点ALB、AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1、CASP3、EGFR进行分子对接，计算核心化合物和关键靶点之间的结合能以预测它们的亲和力，结合能低于0表明2个分子能够自发结合，结合能负值越高提示构象越稳定。分子对接结果(见表3)核心化合物与靶蛋白的最低结合能都小于0，说明紫苏子核心成分能够很好地与关键靶点结合，这也一定程度表明了紫苏子治疗DMI的科学性。综合分析木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亚麻酸、豆甾醇可能是紫苏子治疗DMI的关键成分，可作为未来紫苏子单体成分提取用于治疗糖尿病心肌病的研究对象。

表3 紫苏子活性成分与DMI潜在作用靶点的分子对接结果

3 讨论

对紫苏子治疗DMI的作用网络与潜在机制的研究表明：紫苏子治疗DMI的关键成分可能是木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亚麻酸、豆甾醇。木犀草素能改善DMI，主要是通过逆转心肌组织中AR、NOS及Na+-K+-ATPase活性减轻氧化应激反应[6]，及抑制RhoA/ROCK2信号通路减少糖尿病小鼠心肌细胞凋亡[7]。β-谷甾醇具有抗炎作用，其机制是增强机体氧自由基清除能力[8]，减少NO的合成，抑制巨噬细胞IL-6活性，减少IL-1、TNF-α等炎性因子的分泌[9]。花生四烯酸能通过调节自由基生成、一氧化氮生成、炎症反应和免疫反应等调节糖尿病的发病[10]。饮食中亚麻酸具有降压、调脂等作用，从而保护心血管[11，12]。豆甾醇具有GLUT4葡萄糖转运体靶向作用，通过增加GLUT4的转运和表达改善2型糖尿病[13]。本研究通过网络分析预测发现木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亚麻酸、豆甾醇具有改善DMI的作用，亦有文献证实上述5个单体成分具有改善糖尿病或者具有心血管保护作用，但目前针对DMI的相关研究相对较少，值得进一步研究。

从PPI网络图可发现ALB、AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1、CASP3、EGFR等靶点可能为紫苏子治疗DMI的关键靶点。研究表明炎症反应是DCM发病机制之一，炎症小体可能是治疗DCM的关键靶点，促炎细胞因子(如TNF-α、IL6等)的上调会影响有助于心脏病理性重塑和氧化应激的细胞群，包括心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞[14]。EGFR可加速糖尿病性心肌病大鼠心肌纤维化[15]。Akt1能促进生理性心肌肥大而抑制病理性心肌肥大[16]。CASP3属于促凋亡因子，在细胞凋亡信号的刺激下参与糖尿病胰岛β细胞的凋亡[17]。VEGFA能诱导血管内皮细胞增殖、促进血管新生，预防VEGFA的下调可维持毛细血管密度，从而改善糖尿病对小鼠心脏的损伤[18]。有文献指出，抑制p53能阻止早期细胞凋亡和细胞衰老、减少糖酵解和抑制血管生成，进而改善糖尿病性心肌病[19]。分子对接显示，紫苏子关键成分与以上关键靶点均能有良好的结合，说明紫苏子关键成分和DMI关键靶点有结合活性。

GO分析显示紫苏子治疗DMI主要通过细胞氮化合物反应、有毒物质反应、无机物反应、细胞成分运动的正调控、炎症反应等生物过程发挥作用。KEGG信号通路分析主要集中在癌症通路、PI3K-Akt信号通路、前列腺癌、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化、细胞凋亡、TNF信号通路等。有研究显示，糖尿病患者的AGE水平与血管僵硬度、颈动脉内中膜层厚度成正相关[20]，AGE/RAGE系统的激活使得促纤维生长因子分泌增多，进而胶原沉积导致组织纤维化，导致心肌间质纤维成分增多，造成心肌纤维化、心功能障碍等[21]。PI3K/Akt通路信号通路的表达增加可以抑制核转录因子κB的表达，减轻炎症反应，增加胰岛素敏感性[22]，而长期摄食亚麻酸能通过激活PI3K-Akt信号通路有效减轻糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤[23]。GLUT为PI3K/Akt信号通路的下游信号靶点，PI3K/Akt信号通路通过抑制GLUT-4向细胞膜异位，激活GLUT增加细胞摄取葡萄糖，降低血浆中葡萄糖的水平，从而减轻糖脂毒性[24]。豆甾醇具有GLUT4葡萄糖转运体靶向作用，可能是通过PI3K/Akt信号通路发挥作用。

综上所述，本研究基于网络药理学及分子对接研究紫苏子治疗DMI的机制，发现中药紫苏子通过木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亚麻酸、豆甾醇等药效成分协同作用于ALB、AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1、CASP3、EGFR等多个靶点，参与癌症通路、PI3K-Akt信号通路、前列腺癌、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化等多信号通路改善DMI，为紫苏子的药效物质基础与作用机制研究提供方向，为进一步系统地开展紫苏子单体治疗糖尿病心肌病的研究及临床应用提供理论依据。