猫传染性腹膜炎病毒荧光定量RT-PCR 检测方法的建立

杨 妮，韩佃刚，杨云庆，叶玲玲，李 静，周思佳，宿 放，艾 军，信吉阁

（1.云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201；2.昆明海关技术中心，云南昆明 650200）

猫传染性腹膜炎（feline infectious peritonitis，FIP）是一种由猫传染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus，FIPV）感染引起的病毒性传染病，主要临床症状表现为腹膜炎、腹腔积液及各类脏器肿大[1]，是影响养猫业发展的重要疾病之一。FIPV 属于冠状病毒科冠状病毒属，为不分节段的RNA 病毒，基因组全长29.2 kb，其病毒蛋白包括4种结构蛋白[棘突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）]，5 种辅助蛋白（3a、3b、3c、7a、7b）及2 种非结构蛋白（1a 和1b）[2]。其中，编码M 蛋白和N 蛋白的基因相对保守，适合作为FIPV 检测的分子靶标[3]。

FIP 常用的诊断方法有临床诊断和实验室诊断。临床诊断取决于诊断者经验及患病猫的临床表现，患病猫初期临床症状不明显，病程进展有较大差异，常因误诊而贻误治疗，最终导致病猫死亡。实验室诊断包括病理学检查、血清学检测和病原学检测等[4]。病理学检测耗时较长，制作复杂；血清学检测适合于渗出型FIP，对于非渗出型FIP 存在一定的局限性；常规RT-PCR 检测灵敏度低，容易出现假阴性，荧光定量RT-PCR 方法与常规RT-PCR 检测方法相比，具有准确性好、灵敏度高和特异性强等优点[5-6]。本研究以FIPVN基因为靶序列，设计合成特异性引物及TaqMan 探针，建立了一种FIPV 实时荧光定量RT-PCR 检测方法，并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了试验，以期为提高FIPV 检测效率和FIPV 精准防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 狂犬病毒（RV）、猫疱疹病毒（FHV）、猫杯状病毒（FCV）、猫细小病毒（FPV）、犬流感病毒（CIV）、犬瘟热病毒（CDV），由昆明海关技术中心动检实验室提供。

1.1.2 主要试剂和仪器 病毒RNA/DNA 提取试剂盒，购自宝日医生物技术有限公司；One step qRT-PCR Probe Kit，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；StepOne Plus Real-Time PCR System，购自ABI 公司；PUC57-FIPV-N重组质粒，由昆明擎科生物科技有限公司合成；5430R 高速台式离心机，购自德国Eppendorf 公司；-80 ℃冰箱，购自日本SANYO 公司。

1.1.3 引物和探针设计 下载GenBank 公布的FIPVN基因序列，利用DNAMAN 生物学信息软件分析其保守区域，用Primer 5 软件设计特异性引物和TaqMan 探针（表1），送至昆明擎科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒核酸提取 按照RNA/DNA 提取试剂盒操作说明书分别提取FIPV、RV、FCV、CIV、CDV 的RNA 和FHV、FPV 的DNA，置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 反应体系优化及扩增条件 以阳性重组质粒为模板，最低检测Ct 值为标准，优化荧光定量RT-PCR 反应条件。反应体系20.0 μL：上下游引物各0.4 μL，TaqMan 探针0.2 μL，2×RT-PCR Buffer 10.0 μL、25×RT-PCR Enzyme Mix 1.0 μL、50×Rox 0.4 μL、模板1.0 μL，用ddH2O 补充总体积至20.0 μL。参照酶的说明书设置引物浓度为10 pmol/μL，调整探针浓度分别为2、5、10 μmol/L。扩增条件：55 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s（此步骤收集荧光信号），45 个循环。

1.2.3 特异性试验 采用建立的荧光定量RT-PCR 检测方法，分别对FIPV、RV、FCV、CIV、CDV、FHV、FPV 核酸进行检测，评价方法的特异性。

1.2.4 标准曲线建立和灵敏度试验 使用微量核酸蛋白分析仪测定标准阳性重组质粒浓度，根据公式计算拷贝数（拷贝数=6.02×1023×DNA浓度/质量MW，MW=DNA 碱基数×330），得到拷贝数浓度为3.4×1011copies/μL。对阳性重组质粒进行10 倍梯度稀释，使浓度范围为3.4×108～3.4×101copies/μL。采用建立的荧光定量RT-PCR 检测方法，对上述系列稀释样品进行测定，绘制标准曲线并评价方法的灵敏度。

1.2.5 重复性试验 选取拷贝数浓度为3.4×108、3.4×106、3.4×104、3.4×102copies/μL的阳性质粒，采用同批次配制的荧光定量RT-PCR反应体系进行检测，每个模板设置3 个重复，计算批内变异系数；采用不同批次配制的荧光定量RT-PCR 反应体系进行检测，每个模板设置3 个重复，计算批间变异系数，评价方法的稳定性。变异系数计算公式为CV=（标准偏差SD/平均值Mean）×100%。

2 结果与分析

2.1 反应体系优化

结果（图1）显示，最终确定探针浓度为10 μmol/L。优化后的反应体系：2×RT-PCR Buffer 10.0 μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 1.0 μL，上 下游引物（10 pmol/μL）各0.4 μL，TaqMan 探针0.2 μL，50×Rox 0.4 μL，模板1.0 μL，用ddH2O补充总体积至20.0 μL。

图1 探针浓度优化结果

2.2 特异性试验 利用建立的荧光定量PCR 检测方法分别对FIPV、RV、FCV、CIV、CDV、FPV、FHV 核酸进行检测。结果（图2）显示，该方法仅对FIPV 有特异性扩增，而对上述其他病毒均无扩增，表明该方法具有较强的特异性。

图2 特异性试验结果

2.3 标准曲线建立和灵敏度试验 采用荧光定量RT-PCR 方法检测系列稀释的阳性重组质粒，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的Ct 值为纵坐标，绘制标准曲线。得到标准曲线方程为y=38.445 0 -3.308 3x，可信度（R2）为0.998 9，扩增效率（E）为100.5%（图3）。对阳性重组质粒进行10 倍梯度稀释，评价方法的灵敏度，结果（图4）显示，当阳性质粒拷贝数浓度为3.4 copies/μL 时，仍可见明显扩增曲线，表明本检测方法对FIPV 的检测灵敏度为3.4 copies/μL。

图3 标准曲线

图4 灵敏度试验结果

2.4 重复性试验 选取3.4×108、3.4×106、3.4×104、3.4×102copies/μL 的阳性质粒模板，用本试验建立的荧光定量RT-PCR 方法进行批内、批间重复性测试。结果（表2）显示，该方法的批内变异系数为0.99%～4.13%，批间变异系数为1.29%～4.64%，表明该方法重复性较好。

表2 重复性试验结果

3 讨论

FIPV 于1963 年被首次报道，目前其检测方法仍在不断发展中，特别是在猫没有出现体腔积液的情况下[7]。FIP 常用的诊断方法包括病理学检测、血清学检测、免疫组织学检测和RT-PCR 检测等[8]。RT-PCR 方法是扩增和检测核酸的技术，但其灵敏度低，当腹腔积液中FIPV 含量较少时，容易造成漏检，导致假阴性结果。实时荧光定量RT-PCR 技术具有高效、快速、定量检测病原核酸等优势[9]，已广泛应用于多种病原的检测工作。荧光定量RT-PCR 分为染料法和探针法，荧光染料如SYBR Green I 能直接与DNA 双链结合，结合后产生的荧光信号可被仪器监测，荧光强度与DNA 含量成正比，但由于荧光染料能够结合反应体系里所有的dsDNA 双螺旋小沟区域，因此特异性不如探针法强，且对引物的特异性要求很高[10]。探针法是在上下游引物之间插入一条荧光标记探针，荧光探针与目的模板特异性结合，可大幅提高检测特异性和灵敏度。

目前已有相关学者建立了FIPV 荧光定量RT-PCR 检测方法。如：王元红等[11]针对FIPVN基因设计1 对特异性引物，通过条件优化，建立了一种FIPV 的SYBR Green I 实时荧光定量RT-PCR方法，其最低检出量为102copies/μL，灵敏度低于本研究建立的探针法；Dunbar 等[12]建立了一种从肠系膜淋巴结、细针抽吸物中检测非渗出性FIPV的荧光定量RT-PCR 检测方法，敏感性为90.0%，特异性为96.1%，使非渗出性FIPV 检测成为可能；Fish 等[3]用双标记寡核苷酸TaqMan 探针荧光定量RT-PCR 方法对205 只猫样本进行检测，结果发现了1 例阳性病例；Doenges 等[5]评估了荧光定量RT-PCR 方法检测猫外周血单个核细胞、血清和无细胞体腔积液的灵敏性和特异性，结果显示该方法特异性为100%。

本研究建立的TaqMan 荧光定量PCR 方法灵敏度高，最低检测限为3.4 copies/μL；特异性强，与RV、FHV、FCV、FPV、CIV、CDV等均无交叉反应；重复性好，批内变异系数为0.99%～4.13%，批间变异系数为1.29%～4.64%，可成为FIPV 快速有效的检测手段。