新疆和静县焉耆马体表硬蜱种属鉴定及进化分析

诺明达来，甘 露，才思盖来，郑会珍，刘 燕，吐热古丽，呼尔查，3，巴音查汗

（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.和静县巴伦台镇乌拉斯台村，新疆和静 831412；3.新疆农业大学兽医学博士后流动站，新疆乌鲁木齐 830052）

焉耆马是新疆地区优良马品种之一，是众多马品种中的佼佼者。焉耆马主要分布在新疆的博湖县、和静县、和硕县和焉耆县等地，其中在和静县数量最多[1]。焉耆马善于爬山、涉水，耐高寒、高热，抗病性强，能够在各种草场觅食，具有持久耐劳的特性，素有海马龙驹之称。

蜱是动物体表吸血的节肢动物，其传播病原的危害仅次蚊类，是多种动物和人类疾病的贮藏宿主和传播媒介。蜱隶属节肢动物门蛛形纲蜱螨亚纲寄螨总目蜱目。目前世界上的蜱类有3 科18 属899 种，其中在我国有2 科10 属119 种，而在新疆就有2 科9 属45 种[2]。革蜱属（Dermacentor）全世界已记录的有30 余个种和亚种，其中以古北界种类最多，我国记录的有13 种，仅新疆地区就有8 种[3]。据相关资料[4]记载，全世界约有10%的蜱携带病原体，携带的病原体包括83 种病毒、32 种原虫、20 种立克次体、18 种螺旋体、14 种细菌、2 种线虫、1 种支原体和1 种巴尔通氏体。蜱在动物体表寄生时，以叮咬方式吸血。蜱将螯肢和口下板一同刺入宿主皮肤，造成宿主皮肤充血、水肿，使其不安、疼痛，且引起过敏性皮炎和伤口蛆病等[5]。当动物体表有大量蜱寄生时，由于蜱可分泌毒素和吸取大量血液，引起患畜麻痹、贫血和消瘦等，使毛、皮、奶和肉类产品质量严重下降，给畜牧业带来了严重危害[6]。

本研究从和静县及周边地区，随机采集焉耆马体表及其饲养环境中的硬蜱，运用传统形态学和分子生物学相结合的方法进行蜱种鉴定，并通过生物信息学软件，对采集蜱的COI基因序列进行分析，以期为后期开展地方性蜱种研究与蜱传疾病防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

1×磷酸缓冲液（PBS）、10%氢氧化钠、琼脂糖、溴化已锭、载玻片、盖玻片，均购自北京鼎国生物技术有限责任公司；树脂型TM 基因组DNA 提取试剂盒、蛋白酶K、2×EcoTaqPCR Super Mix，购自北京赛百盛基因技术有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒，购自康为世纪生物工程有限公司；MoticSMZ-16B 体视显微镜，购自麦克奥迪事业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 2022 年3—5 月，采集和静县自然放牧马体表寄生和饲养环境中的蜱830 只，用70%酒精保存，并做好标记，带回实验室进行形态学和分子生物学鉴定。

1.2.2 玻片制作及形态学鉴定 将蜱虫体按以下步骤制作标本[6]：投入沸水中1～2 min，待肢体伸直后将其放入已经加温的10% NaOH 溶液中煮沸数分钟（对较大的虫体，须用昆虫针在虫体上刺些小孔，以利虫体内部组织溶出），直至虫体内部的肌肉和内脏被溶解排出；至虫体软化透明时，将其取出放入清水中洗去碱液，洗时轻轻压挤虫体，使内容物排净（或把虫体置吸水纸上轻轻压挤，使内容物排出后被吸水纸吸附），再置清水中清洗；洗净后的虫体依次经过30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精以及体积比1:1 的无水酒精二甲苯和纯二甲苯各浸泡0.5～1 h（较大虫体时间取高限），然后用加拿大树胶封片。参照《新疆蜱类志》[7]和《蜱类学》[8]的昆虫分类标准，利用普通光学显微镜对采集到的蜱进行初步鉴定，利用数码体视显微镜进一步对比其背面、腹面、假头、假头基、躯体、盾板、颈沟、侧沟、肢节IV、气门板等。

1.2.3 蜱样处理及DNA 提取 从经初步形态学鉴定的蜱中随机挑选3 只，用1×PBS 洗3 次，清洗干净后蜱放入一次性采血器中，倒入液氮用研钵磨碎，加入200 μL 1×PBS 吹打混匀后加入到EP 管内，再加入200 μL GA 液和20 μL 蛋白酶K（proteinese K），放至水浴锅内2～3 h，使其完全溶解，以提高蜱DNA 浓度；随后，按照树脂型基因组DNA 提取试剂盒说明书提取其DNA，-20 ℃保存。

1.2.4COI基因引物设计 参考文献[9]设计COI基因引物序列（表1），对5 个采样点的蜱DNA 进行COI基因PCR 扩增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应体系：2×EcoTaqPCR Super Mix 6.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 补足至13.0 μL。

表1 引物序列

1.2.5COI基因扩增及克隆 以提取的蜱DNA为模板，对COI基因进行PCR 扩增。PCR 扩增体系 为25.0 μL：TaqMix 12.5 μL、ddH2O 7.5 μL、上游引物2.0 μL、下游引 物2.0 μL、DNA 模板1.0 μL。COI基因 PCR 扩增条件：95 ℃预变性5 min；95℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环[10]。PCR 扩增结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳，按照Axy GEN DNA 凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段，胶回收产物与pMD19-T载体连接。连接体系为10 μL：pMD19-T 1 μL、PCR 产物4 μL、solution I 5 μL。冰浴30 min 后，加入感受态细胞50 μL，热激42 ℃、45 s，冰浴2 min；加入无抗性液体培养基900 μL，摇菌培养1 h；出现絮状物后，10 000 r/min 离心4 min，弃掉850 μL 上清，将剩余的150 μL 吹打混匀，然后加入到含氨苄青霉素的普通固体培养基上涂布均匀，放入37 ℃恒温箱，前30 min 正面放置，后倒置过夜；待普通固体培养基上长出单菌落时进行菌液PCR 检测，将出现阳性条带的进行保菌，保存至-80 ℃，送上海生工生物科技有限公司测序。

1.3 同源性比较及系统进化树构建

利用Meagalign 与Mega11.0 生物学软件中的邻接法（NJ）进行同源性比较及遗传进化树构建。分析模型为Tamura 3-parameter，进行1 000 次自主复制，以确定模型的稳定性，最终获得系统发育进化树。

2 结果

2.1 形态学鉴定

在采集的830 只蜱中，经形态学鉴定，鉴定出421 只边缘革蜱、306 只草原革蜱、103 只森林革蜱，均属于革蜱属，具体见表2。

表2 焉耆马体表及环境中采集到的蜱种及数量 单位：个

2.1.1 初步形态学鉴定 边缘革蜱雄蜱背面（图1-A）和腹面（图1-D）：体呈卵圆形，前部渐窄，后部宽圆，假头基呈卵圆形，宽稍大于长；侧缘几乎平行，后缘向内微弯；基突粗短，长小于基部之宽；须肢粗短，外缘呈弧形凸出，第2 节略长于第3 节，后缘有很短的背侧，末端圆钝。草原革蜱雄蜱背面（图1-B）和腹面（图1-E）：体呈卵圆形，假头基呈矩形，宽略大于长，基突宽短；须肢宽短，外缘呈圆弧形，第2 节背后缘有细小的短刺。森林革蜱雄蜱背面（图1-C）和腹面（图1-F）：假头基呈矩形，宽稍大于长，两侧几乎平行；盾板呈卵圆形，盾窝之后的水平最宽，向前渐窄，向后宽圆；表面珐琅彩较淡，前半部及中间较多，后半部较少。

图1 雄蜱外部形态（20×）

2.1.2 细微形态学鉴定 在光学显微镜下，边缘革蜱、草原革蜱、森林革蜱的假头基形状，躯体形状，盾板表面珐琅彩的分布颈沟和侧沟，以及肢节IV、气门板，都具有一定的区别，具体见表3。

表3 焉耆马体表3 种革蜱光学显微镜下的主要鉴定特征

2.2 分子生物学鉴定

2.2.1COI基因PCR 扩增 PCR 扩增蜱线粒体COI基因片段，经12 g/L 琼脂糖凝胶电泳分析，发现在709 bp 处有目的条带，条带大小与预期片段大小一致（图2）。

图2 COI 基因PCR 扩增结果

2.2.2 同源性比较及遗传进化树构建 同源性比对结果（图3）显示；测序获得的边缘革蜱COI基因序列与选取的参考株同源性为99.2%～99.8%，其中与新疆株（HM193889、HM193890）同源性达99.8%；草原革蜱COI基因序列与选取的参考株同源性为99.8%～100%，其中与新疆株（KF583573）同源性为100%；森林革蜱COI基因序列与选取的参考株同源性为99.3%～99.6%，其中与新疆株（MH079424））同源性为99.6%，与山西株（MK213073）同源性为99.3%。

图3 同源性比较结果

构建的遗传进化树（图4）显示：边缘革蜱COI基因与新疆株（HM193889）位于同一分支上，进化关系较近，与另一新疆株（HM193890）关系稍远；草原革蜱COI基因与新疆株（KF583573）位于同一分支，进化关系较近；森林革蜱COI基因与新疆株（MH079424）和山西株（MK213073）分属两个分支，进化关系稍远。以上3 种鉴定的革蜱COI基因与璃眼蜱属小亚璃眼蜱株的进化关系较远。

图4 COI 基因系统进化树

3 讨论

蜱类研究主要包括：探索蜱类自身功能（生物学特征、生理学特征、媒介潜能等），掌握“蜱类-宿主-疾病”关系（分子生物学等），以及防治蜱及蜱传疾病（化学、免疫学、物理学或其他）三个方面，但无论在哪个方面，准确鉴定蜱种是蜱类研究的先决条件和基础[11]。

形态学鉴定的优势在于，可以很清晰地观察到蜱的细微结构（假头基、躯体、盾板、颈沟和侧沟、肢节IV、气门板等），耗时较短，对实验设备及检测人员能力要求较低，缺点是准确性较低，容易混淆。分子生物学检测与形态学鉴定相比，灵敏度和特异性均显著提高，缺点是耗时较长，对实验设备及检测人员能力要求较高。硬蜱属特征明显，易于区分，而硬蜱种间存在遗传变异。随着人们对生物大分子的深入理解，分子生物学方法在准确鉴定物种方面发挥了重要作用，甚至是推动医学检验发展的重要力量[12]。本研究从和静县5 个马场采集了830 只蜱，通过体式显微镜和数码光学显微镜初步鉴定出边缘革蜱、草原革蜱、森林革蜱等3 种硬蜱；通过分子生物学（PCR 技术）鉴定，经同源性比较发现，这3 种硬蜱与同种蜱基因序列同源性达99.0%以上。进化分析发现，本次鉴定的边缘革蜱、草原革蜱分别与新疆境内的同种革蜱聚类为同一分支，但均与国内其他地区的蜱种分处于不同的遗传进化分支；森林革蜱与新疆境内及国内其他地区的森林革蜱处于不同的进化分支。这说明以上3 种蜱中，边缘革蜱、草原革蜱具有较完整的遗传进化特征，而森林革蜱遗传进化特征不够完整。此数据可为地方蜱及蜱媒病防治奠定基础。