不同ELISA 试剂盒评价口蹄疫O 型、A 型二价灭活苗免疫效果对比

孙秀涛，沈学文，段文学，江红梅，马 琛，普星星，周 卓，谢居昆，王 薇，杨 东，孟 莉，石露莎，高 芸，段平波，何克灿，张荣华

（1.红河州动物疫病预防控制中心，云南蒙自 661199；2.建水县动物疫病预防控制中心，云南建水 654399；3.泸西县动物疫病预防控制中心，云南泸西 652400；4.弥勒市动物疫病预防控制中心，云南弥勒 652399；5.红河州动物卫生监督所，云南蒙自 661199）

口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）感染偶蹄动物引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，一旦疫情发生将会造成巨大经济损失和严重社会影响。世界动物卫生组织（WOAH）将其列为须报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[1]。FMD 传染源主要为潜伏期感染及临床发病动物，易感动物可通过呼吸道、消化道、生殖道和伤口感染病毒。牛羊等反刍动物感染后，会在食道-咽喉部持续带毒。

FMDV 有7 个血清型，分别为O、A、Asia 1、C、SAT 1、SAT 2 和SAT 3，不同血清型之间无交叉保护反应[2]。FMD 属于我国重大动物疫病强制免疫病种，疫苗免疫注射是最有效的防控措施。因此，对疫苗的免疫效果进行科学评价尤为重要。免疫效果评价的技术手段主要是抗体检测，但是不同的检测方法、检测试剂会导致抗体检测结果的差异[3]。ELISA 方法具备简便、敏感、稳定、易操作等优势，是目前实验室检测动物免疫血清抗体主要的技术手段。本试验选取了市面上3 个不同厂家生产的ELISA 试剂盒，同时检测了3 个免疫不同口蹄疫O 型、A 型二价灭活苗羊场的抗体水平，以期为选取合适的抗体检测试剂盒提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 在3 个县市各选取1 家养殖管理条件较好的规模羊场，每个场选取120～150 日龄健康羊30 只，按照正常饲养条件单独圈养。

1.1.2 疫苗种类 选取3 种政府招标采购的口蹄疫O 型、A 型二价灭活疫苗，分别在3 家养殖羊场中各免疫1 种，免疫程序和免疫剂量按照说明书进行。

1.1.3 样品准备 免疫前采集羊食道-咽部黏液（O-P 液）和血清样品，首免后28 d 和二免后28 d 采集羊全血样品。样品经3000 r/min 离心2～5 min 后取上清液，置于2 mL 离心管中，-20 ℃保存备用。

1.1.4 检测试剂 FMDV 通用型荧光RT-PCR 试剂盒（批号040192003），购自青岛立见诊断技术发展中心；非结构蛋白抗体ELISA 检测试剂盒（批号FMDV20200507），购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；3 种待测ELISA 试剂盒：S1（批号为1FMDO20096 和1FMDA20036）、S2（批号为020092015 和020071906）、S3（批号为20200928133 和20200927134）。

1.2 方法

1.2.1 实验室检测 根据FMDV 通用型荧光RT-PCR 试剂盒、非结构蛋白抗体ELISA 检测试剂盒和3 种不同厂家生产的ELISA 抗体检测试剂盒说明书，分别对FMDV 病原、感染抗体及免疫抗体进行检测。

1.2.2 数据分析 采用SPSS 25.0 软件，通过单因素方差分析方法，比较不同ELISA 试剂盒检测抗体合格率的差异，P＜0.05 代表差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 FMDV 病原及感染抗体检测

免疫前，分别采集试验羊的O-P 液样品和血清样品各90 份，运用通用型荧光RT-PCR 试剂盒检测FMDV 病原，非结构蛋白抗体ELISA 试剂盒检测FMDV 感染抗体，结果两者均为阴性。

2.2 不同羊场免疫抗体检测

2.2.1 羊场一 结果（表1）显示：首免后28 d，S1、S2两种试剂盒检测的O型抗体合格率分别为96.55% 和100%，而S3 的检测合格率仅为55.17%；检测的A 型抗体合格率为13.79%～72.41%。二免后28 d，3 种试剂盒检测的O 型抗体合格率为96.55%～100%，A 型抗体合格率为58.62%～82.76%。29 份血清样品用3 种试剂盒检测O 型抗体均为阳性的血清28 份，均为阴性的血清1 份，符合率为100%（29/29）；检测A型抗体均为阳性的血清16份，均为阴性的血清4份，不同结果的血清9 份，符合率为68.97%（20/29）。

表1 羊场一免疫抗体检测结果

2.2.2 羊场二 结果（表2）显示：首免后28 d，S2 试剂盒检测O 型、A 型抗体合格率分别为79.31% 和75.86%，S1 和S3的检测合格率为27.59%～62.07%；二免后28 d，S2 试剂盒检测O 型、A 型抗体合格率分别提高到了89.66%和93.10%，S1 和S3 检测O 型抗体合格率分别提高到了89.66%和82.76%，但检测A 型抗体合格率分别为55.17%和51.72%。29 份血清样品用3 种试剂盒检测O 型抗体均为阳性的血清21 份，8 份血清结果不一致，符合率为72.41%（21/29）；检测A 型抗体均为阳性的血清13 份，均为阴性的血清1 份，其他15 份血清的结果不同，符合率仅为48.28%（14/29）。

表2 羊场二免疫抗体检测结果

2.2.3 羊场三 结果（表3）显示：首免后28 d，除S1 试剂盒检测的A 型抗体合格率为58.62%外，S2、S3 检测O 型、A 型抗体合格率及S1 检测O型抗体合格率均达到国家70%以上的要求；二免后28 d，S1 检测A 型抗体合格率下降为55.17%，S2、S3 检测O 型、A 型抗体合格率有所提高，达到了75.86%～100%。29 份血清样品用3 种试剂盒检测O 型抗体均为阳性的血清21 份，均为阴性的血清2 份，6 份血清结果不一致，符合率为79.31%（23/29）；检测A 型抗体均为阳性的16 份，其他血清的结果不一致，符合率为55.17%（16/29）。

表3 羊场三免疫抗体检测结果

2.3 不同FMD 血清型检测结果

3 家规模羊场使用不同疫苗二次免疫后，3 种试剂盒检测O 型抗体的合格率都较高，合格率为75.86%～100%，各试剂盒检测O 型抗体合格率均值分别为82.18%、86.21%、74.71%，无显著性差异（P＞0.05）。3 种试剂盒检测A 型抗体合格率为51.72%～100%，各试剂盒检测A 型抗体合格率均值分别为49.42%、85.06%、55.75%，其中S2与S1、S3 之间差异显著（P＜0.05），S1 和S3之间差异不显著（P＞0.05）。结果说明，3 种ELISA 试剂盒均适用口蹄疫O 型抗体检测，S2 试剂盒与S1、S3 试剂盒相比，更适合A 型抗体检测。

3 讨论

FMD 是危害我国畜牧业健康发展的重要动物疫病之一，主要感染猪、牛、羊等偶蹄类动物，动物一旦感染发病会对养殖场户造成重大经济损失。目前，疫苗免疫是防控FMD 最有效的措施。动物机体通过体液免疫产生抗体获得保护，因此检测抗体合格率水平，不仅可以客观反映疫苗免疫后动物个体、群体所处的保护状态，也是对免疫效果的直接评估[4]。

本试验比较了市面上3 种常见的ELISA 试剂盒检测口蹄疫O 型、A 型二价灭活疫苗免疫抗体合格率的差异。从二免后的抗体检测结果来看，3家试剂盒检测O 型抗体合格率均达到了国家要求的70%以上，且三者符合率为72.41%～100%。而对于A 型血清型，除S2 试剂盒的检测合格率介于82.76%～100%，S1 检测场二和场三的免疫抗体合格率及S3 检测场一和场二的免疫抗体合格率均低于70%，且三者符合率为48.28%～68.97%，差异显著（P＜0.05），这可能与试剂盒中A 型抗原差异有一定的相关性，这也符合田间监测情况。

综上所述，不同ELISA 试剂盒评价口蹄疫免疫效果存在一定差异，其中检测A 型抗体试剂盒差异显著（P＜0.05）；3 种ELISA 试剂盒均可用于口蹄疫O 型抗体检测，S2 试剂盒适合A 型抗体检测。提示在评价口蹄疫O 型、A 型二价灭活疫苗的免疫效果时，如果两血清型之间抗体合格率差别比较大，需要考虑调整检测合格率低的试剂盒，以达到科学评价的目的。