2021 年北京市兽医实验室非洲猪瘟病毒核酸检测能力比对

吴 迪，杜 鹃，王 林，史 记，程敏姮，赵浩军，周德刚，吴惠明

（北京市动物疫病预防控制中心，北京 102629）

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染家猪和野猪引起的一种广泛出血性、高度接触性传染病，其特征为病程短，呈最急性和急性感染，死亡率可达100%[1]，是全球公认的养猪业第一杀手。世界动物卫生组织（WOAH）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[2]。

2018 年非洲猪瘟疫情在北京市暴发，北京市动物疫病预防控制中心共委托17 家兽医实验室开展非洲猪瘟病毒核酸检测工作，包括区级兽医实验室10 家，非洲猪瘟第三方授权实验室7 家。实验室间能力比对是评价实验室检测水平的重要手段[3]。2021 年，根据《农业农村部办公厅关于做好非洲猪瘟实验室检测工作的通知》（农办牧〔2018〕54号）[4]、《农业农村部办公厅关于进一步做好非洲猪瘟实验室检测工作的通知》（农办牧〔2018〕66号）[5]等文件要求，北京市动物疫病预防控制中心组织17 家兽医实验室开展了非洲猪瘟病毒核酸检测能力比对工作。本研究依据《利用实验室间比对进行能力验证的统计方法》（GB/T 28043—2019）[6]，对各实验室非洲猪瘟病原学检测结果进行了统计分析，以期为深度挖掘实验室检测数据，持续提升实验室检测能力奠定基础。

1 材料与方法

1.1 参加能力比对兽医实验室

2021 年，北京市动物疫病预防控制中心组织10 家区级兽医实验室与7 家非洲猪瘟第三方授权实验室开展非洲猪瘟病毒核酸检测能力比对试验，北京市动物疫病预防控制中心实验室对盲样进行了检测。共计获得18 家兽医实验室检测数据，实验室编号为1～18。

1.2 试验设计与参比项目

1 000 copies/μL（Ct=29）、100 copies/μL（Ct=33）与阴性对照3 种比对质控样品，由中国动物卫生与流行病学中心非洲猪瘟国家参考实验室提供。每组设置6 份盲样，其中1 000 copies/μL 比对盲样2 份，100 copies/μL 比对盲样3 份，阴性比对盲样1 份。每组盲样独立包装并置于-20 ℃保存。

参比项目为非洲猪瘟病毒荧光定量PCR 检测。各实验室统一领取比对盲样，统一选用青岛立见诊断技术发展中心非洲猪瘟病毒荧光PCR 检测试剂盒作为比对试验诊断试剂，检测标准参照试剂盒说明书。

1.3 数据处理

依据文献[6]，分别采用箱线图、稳健统计Z比分数、尧敦图等统计方法，对各实验室非洲猪瘟病原学检测结果进行统计分析。

1.3.1 频率分布直方图 以18 家兽医实验室100 copies/μL 与1 000 copies/μL 比对盲样检测数据为基础，绘制频率分布直方图，检验检测数据是否符合正态分布。若符合正态分布，则利用平均值±标准差对18 家参比实验室的检测结果进行统计分析。

1.3.2 箱线图 以18 家兽医实验室100 copies/μL与1 000 copies/μL 比对盲样检测数据为基础，统计中位数、均值、组间SD、组间CV 等数据，绘制箱线图，反映数据分布的中心位置和散布范围。

1.3.3 稳健统计Z比分数 以18 家兽医实验室100 copies/μL 与1 000 copies/μL 的比对盲样检测数据为基础，计算Z比分数，公式为

式中，Z代表兽医实验室的检测结果xi与平均值x的偏离程度。|Z|≤2，结果判定为满意；2 ＜|Z|＜3，结果判定为可疑，需要查找原因；|Z|≥3，结果判定为不满意，需要查找原因整改。s代表标准偏差。符号“+”与“-”代表xi与平均值x的偏离方向。

1.3.4 尧敦图 以18 家兽医实验室1 000 copies/μL的比对盲样Z比分数为X轴，以100 copies/μL 比对盲样Z比分数为Y轴，画出垂直线和水平线，创建四个象限，辅助进行数据分析。检查图中远离数据中心的点，若实验室未遵循正确检测方法，其结果会受系统误差影响，存在较大偏倚，会在左下象限和右上象限出现远离点；若实验室出现随机误差，会在左上象限和右下象限出现远离点。

2 结果与分析

2.1 频率分布直方图

频率分布直方图（图1）显示，18 家实验室的100 copies/μL 与1 000 copies/μL 比对盲样检测数据均呈近似正态分布。

图1 盲样频率分布直方图

2.2 核酸检测比对

对18 家参比实验室检测的盲样结果进行统计分析，盲样标定为1 000 copies/μL 与100 copies/μL，取平均值±标准差作图。结果（图2）显示，盲样标定为100 copies/μL 时，编号16 号实验室标准差相比其他实验室较高。

图2 18 家实验室非洲猪瘟病毒核酸检测比对结果

2.3 箱线图

箱线图结果（图3）显示，在1 000 copies/μL盲样检测中无异常点，在100 copies/μL 盲样检测中存在一个异常点，结合表1，显示异常Ct 为45.000。

表1 不同浓度盲样比对结果分析

图3 箱线图结果（异常值用红点标出）

2.4 稳健统计Z 比分数

结果（图4）显示，全部36 份1 000 copies/μL比对盲样检测结果中，结果判定为满意的有35 份，占97.2%；可疑样品1 份，来自3 号实验室，Z值为-2.25。

图4 18 家实验室1 000 copies/μL 比对盲样Z 比分数分布

结果（图5）显示，全部54 份100 copies/μL比对盲样检测结果中，结果判定为满意的有52 份，占96.3%；可疑样品1 份，来自3 号实验室，Z值为-2.04；不满意样品1 份，来自16 号实验室，Z值为4.43。

图5 18 家实验室100 copies/μL 比对盲样Z 比分数分布

2.5 尧敦图

结果（图6）显示，16 号实验室在95%置信椭圆外，出现在右上象限，显示已离群，提示该实验室出现系统误差。

图6 18 家实验室比对样品Z 值尧敦图

3 讨论

本次区级兽医实验室非洲猪瘟病毒核酸检测能力比对结果显示：16 号实验室的1 份标定为100 copies/μL 的盲样检测Ct 为45.000，且无扩增曲线，结合检测标准（当Ct ≥40 时判为阴性），判定检测结果不合格，其余17 家检测结果均为符合。虽然17 家检测结果为符合的实验室在本次能力比对中阴阳性结果判定正确，但一些实验室也存在检测结果预警情况。其中12、15 号实验室在100 copies/μL 盲样检测中重复性较差，标准偏差较大，但在1 000 copies/μL 盲样检测中重复性较好，标准偏差较小。4、11、13 号实验室在1 000 copies/μL 盲样检测中重复性较差，但在低浓度100 copies/μL 盲样检测中重复性较好。8 号实验室在1 000 copies/μL 与100 copies/μL 盲样检测中标准偏差均较大，样品重复性较差。

尧敦图检测结果可以反映实验室的系统误差与随机误差，含有明显系统误差的实验室将在右上象限（正偏差）与左下象限（负偏差）出现偏离点，即检测的两个样品结果会同时出现异常高值或低值；而随机误差将在左上象限与右下象限出现偏离点，即一个样品的检测值高，另一个样品的检测值低。比对本次18 家实验室检测结果发现，16 号实验室已离群，存在明显系统误差，11、12 号实验室存在随机误差，建议在下轮比对试验中持续跟踪。3 号实验室在1 000 copies/μL 样品Z比分数为-2.25，在100 copies/μL 样品Z比分数为-2.04，均显示可疑，但3 号实验室的检测Ct 值较其他实验室比较靠前，可能是因为3 号实验室采用核酸提取方法提取效率较高。

本研究依据《利用实验室间比对进行能力验证的统计方法》（GB/T 28043—2019）中能力计量的评定运算，采用箱线图、稳健统计Z比分数、尧敦图等统计方法，对各实验室比对数据进行了统计分析，使区级兽医实验室非洲猪瘟病毒核酸检测比对不仅可以依靠阴阳性结果进行判读，还可以通过统计方法深度分析出各实验室的系统误差与随机误差。结果提示，各实验室应持续加强质量控制，保持和提高实验室检测能力水平。