实际生产中化制法无害化处理病死猪的病毒杀灭效果

刘梅芬，马震原，闫若潜，赵雪丽，谢彩华，王 翠，柴 茂，赵美雪，宋 丹，王东方，刘 影，靳 冬，王淑娟

（河南省动物疫病预防控制中心，河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室，河南郑州 450008）

我国每年因动物疫病导致禽畜死亡的数量巨大，给畜禽养殖业带来的经济损失每年超过200 亿元[1]。若病死动物未经无害化处理而流入市场或污染环境，将直接威胁养殖业健康发展和人类身体健康[2]。对病死及病害动物及其相关动物产品进行无害化处理是避免病原扩散及传播的有效途径。

无害化处理是用物理、化学等方法处理病死、病害动物及其相关动物产品，消灭其所携带的病原体，消除危害的过程[3]。无害化处理方法有焚烧法、化制法、深埋法、高温法和硫酸分解法等。焚烧法虽能通过氧化反应或热解反应杀死病原，但存在空气污染隐患；深埋法如果填埋不当，容易造成水源及土壤污染，且操作成本高，还存在病原溢出及掩埋的病死动物尸体被动物扒出撕咬或人为挖出流入市场的风险[4]；硫酸分解法存在过量硫酸污染水源和土壤的风险；高温法处理时间较长、成本高，且存在受热不均、病原体杀灭不彻底的风险。上述方法都存在二次污染环境的风险和生物安全风险[5]。化制法是指在密闭的高压容器内，向容器夹层或容器内通入高温饱和蒸汽，在干热、压力或蒸汽、压力的作用下，处理病死、病害动物和相关动物产品的方法。化制法和高温法均指在封闭容器内高温处理，高温法为常压条件下杀灭病原微生物，而化制法为高温高压法，具有杀灭效果好、处理效率高、处理能力强等优点，处理效果优于高温法。化制法是目前国内无害化处理厂使用最为广泛的无害化处理工艺[6]。

本研究自3 个应用化制法工艺处理病死猪尸体的规模化猪场，采集无害化处理前及经化制法无害化处理后的病死猪尸体样品，利用实时荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）方法，检测每份样品中的常见猪病病原核酸，包括非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、口蹄疫病毒（FMDV）、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）与猪流行性腹泻病毒（PEDV）等。将病原核酸检测阳性的样品分别在BHK21、Vero、PK15 和Marc145 等4 种细胞上进行病毒分离培养并盲传3 代，利用相应PCR 方法对细胞培养物进行上述病原的核酸检测，通过病毒分离培养物中病原核酸检出情况，评估该工艺在实际生产应用中无害化处理病死猪尸体的病毒杀灭效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品 选取3 个应用化制法工艺处理病死猪尸体的规模化猪场（编号A、B、C），其中A、C 场采用干化法，B 场采用湿化法。病死猪尸体处理之前，在每个猪场各采集3 个批次的包含淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、小肠、胎衣等的混合样品各1 份（分别编号A1～3、B1～3、C1～3），无害化处理后采集对应批次的固体样品。无害化处理前后各采集样品9 份。

1.1.2 主要试剂 磁珠法核酸提取试剂盒，购自西安天隆科技有限公司；ASFV（GB/T 18648—2020）、CSFV（GB/T 16551—2020）、PCV2（GB/T 35901—2018）、PRV（GB/T 35911—2018）、FMDV（GB/T 18935—2018）、PRRSV（GB/T 35912—2018）等病原的FQ-PCR 检测方法所用引物探针，均由上海英骏生物技术有限公司合成，并依据各自的国家标准自行配制；TGEV、PEDV、PPV 实时荧光PCR检测试剂盒，购自洛阳莱普生生物科技有限公司；以上病原的阳性对照质粒，由河南省动物疫病预防控制中心实验室提供；DMEM 培养基，购自武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清，购自上海联硕生物科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix、ExTaqDNA 聚合酶、dNTPs、酶抑制剂等，均购自宝生物工程（大连）有限公司；M-MLV 反转录酶等，购自Promega 公司。

1.1.3 主要仪器设备 二级生物安全柜，美国Baker 公司产品；全自动核酸提取仪，西安天隆科技有限公司产品；荧光PCR 仪，美国ABI 公司产品；台式离心机、CO2培养箱，美国Thermos 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 处理前后样品病原核酸检测 利用上述检测方法和试剂盒检测无害化处理前后样品中的ASFV、CSFV、PCV2、PRV、FMDV、PPV、PRRSV、TGEV 和PEDV 等病原核酸。

1.2.2 阳性样品病毒分离培养 将1.2.1 中病原核酸检测阳性的样品，按照常规病毒分离方法[7]，分别在BHK21、Vero、PK15 和Marc145 等4 种细胞上进行病毒分离培养并盲传3 代。

1.2.3 病毒分离培养物病原核酸检测 对每一代病毒分离培养物进行ASFV、CSFV、PCV2、PRV、FMDV、PPV、PRRSV、TGEV 和PEDV 等病原核酸检测。

2 结果

2.1 处理前后样品病原核酸检测

化制法无害化处理前，A1 和A3 检出PCV2和PRV 核酸阳性，A2 检出PCV2 核酸阳性，B1、B2、B3 均检出PCV2 和PEDV 核酸阳性，C1、C2 均检出PRV 核酸阳性。化制法无害化处理后，A1 检出PCV2 和PRV 核酸阳性，A2 和A3 检出PCV2 核酸阳性，B3 检出PCV2 核酸阳性，其余均为核酸阴性。

2.2 阳性样品病毒分离培养

根据2.1 的结果，将处理前后的A1、A2、A3、B3 样品和处理前的B1、B2、C1、C2 共12份样品分别在BHK21、Vero、PK15 和Marc145 等4 种细胞上进行病毒分离培养并盲传3 代。结果显示，只有处理前的A1、A3、B1、C1 和C2 共5 份样品可以引起细胞病变，其中处理前A1、A3、C1和C2 引起PK15 细胞病变，B1 引起Vero 细胞病变（图1、2）。

图1 样品在PK15 细胞上的培养结果

图2 样品在Vero 细胞上的培养结果

2.3 病毒分离培养物病原核酸检测

将12 份样品在各细胞上的每一代病毒分离培养物进行病原检测。结果（表1）显示：15 份处理前样品培养物中检出病原核酸阳性，其中A1、A3、C1 等3 份样品的1～3 代培养物均检出核酸阳性，说明存在活病毒；而经化制法无害化处理后样品的培养物均未检出核酸阳性，说明未有活病毒。

表1 培养物中病原核酸检测结果

3 讨论

病死动物存在大量的病原微生物，是多种动物疫病发生与传播的重要传染源之一[8]。科学有效处理病死动物，可阻止病原微生物在环境中的生存、传播和扩散，避免对环境的污染和对人的危害，从而维护生态环境安全和公共卫生安全，对维护国家公共卫生和生物安全具有重要意义。

化制法分为干化法和湿化法。干化法主要是将病死畜禽尸体进行破碎后送入高温高压的容器中，温度高于140 ℃，压力大于0.5 MPa，处理时间大于4 h，经加热烘干后产生的热蒸汽经废气处理系统排出，尸体残渣经压榨系统进行处理；湿化法则需要利用蒸汽进行高温、高压处理后对处理物进行初次固液分离，固体物经破碎后送入烘干系统，液体则送入油水分离系统进行处理[9]。化制法是现行《病死及病害动物无害化处理技术规范》中明确的病死及病害动物和相关动物产品的处理方法之一，也是目前国内无害化处理厂使用最为广泛的无害化处理工艺，但其在实际生产环节的落实情况未见公开报道，本研究就是针对这一问题开展的。本研究所采集的样品既有干化法也有湿化法处理前后的病死猪尸体样品。A 场和C 场采用的是干化法无害化处理，工作条件为140 ℃、0.5 MPa，工作时间5 h；B 场采用的是湿化法无害化处理，工作条件为135 ℃、0.3 MPa，工作时间5 h。

本研究之所以选择BHK21、Vero、PK15 和Marc145 这4 种细胞，是因为这4 种细胞可以增殖出涵盖ASFV、CSFV、PCV2、PRV、FMDV、PPV、PRRSV、TGEV 和PEDV 等的常见猪病病原。PRV、FMDV 可在BHK21 细胞上增殖[10-11]，CSFV、PCV2、PPV、TGEV 可在PK15 细胞上增殖[12]，PEDV 可在Vero 细胞上增殖[13]，PRRSV可在Marc145 细胞上增殖[14]。在无害化处理前后样品的病原核酸检测结果中，出现处理前样品为病原核酸检测阳性而处理后核酸检测阴性的情况，是因为在化制法处理前，样品中存在大量具有生物学活性且能在细胞中传代的病原，而无害化处理过程中病原被杀死且其核酸被破坏，所以处理后样品为病原核酸检测阴性。培养物病原核酸检测结果中，一些样品出现第1 代培养物为核酸检测阳性，而第2 代和第3 代培养物为核酸检测阴性，是因为样品中存在的病原核酸残留在第1 代培养物中，但其病原已经被杀死，不能在细胞上稳定增殖，而第2 代和第3 代培养物中的病原核酸被大量稀释，致使检测结果为阴性。

本研究利用FQ-PCR 方法，对化制法处理前后的样品进行常见猪病病原核酸检测，将筛选出的病原核酸检测阳性样品进行病毒分离培养并盲传3代后，再对增殖的每一代培养物进行病原核酸检测，结果显示化制法处理前病死猪尸体样品中存在活病毒可增殖传代，而化制处理后样品的细胞培养物中均未发现活病毒，说明化制法在实际生产应用中能有效杀死病死猪尸体样品中的活病毒，达到了无害化处理目标。

本研究只进行了常见病毒的无害化处理效果对比，但选取的病毒，既有DNA 病毒也有RNA病毒，因此研究结果具有一定代表性。本研究未对细菌杀灭效果进行试验，是因为在样品采集过程中，样品会受很多杂菌影响，试验设计中尚难以排除。