中药痰热清注射液治疗支气管炎的网络药理学作用机制研究

杨书彬，柳嘉欣，赵金荣，苏虹婵，孙健，王毅(通信作者)

1.黑龙江中医药大学(黑龙江 哈尔滨 150040)； 2.中国中医科学院 医学实验中心(北京 100010)

支气管炎是指气管、支气管黏膜及其周围组织的非特异性炎症。临床以反复咳、喘及多痰为特点。其发病率高，难以医治，现代医学常以抗感染、抗过敏为主，愈后效果不佳，往往反复发作，严重危害人类的健康[1]。中医理论认为，支气管炎属于“咳嗽”“痰证”“喘证”的一类病症[2]，与痰热郁肺症、风寒袭肺症、风热犯肺症以及气阴两虚证等辨证分型有关[3]。中医以清热解表、宣肺止咳作为治疗原则，临床中收到满意治疗效果。

痰热清注射液是经典的治疗呼吸道炎症的中药方剂，包含黄芩、熊胆粉、连翘等中药，是在“双黄连”和“清开灵”两种清热解毒药物基础上优化而成。可通过改善患者“风温肺热”病中的喘、咳、热等痰热郁肺症状，进而起到治疗支气管炎的作用。目前，临床已证明痰热清注射液对急慢性支气管炎都有很好的疗效[4-7]，但由于其有效成分复杂，其目前作用机制尚不清楚，很难对其从整体到分子水平系统全面地认识该药，因此一定程度上影响其临床疗效的发挥。

网络药理学是以系统生物学、多向药理、计算机技术为基础，以“疾病-基因-靶点-药物-多层次、多角度”为核心的分析方法，应用于中药分子机制研究具有独特优势[8]。本研究运用网络药理学研究方法，阐明痰热清注射液有效成分治疗支气管炎的作用机制，以期为痰热清注射液抗支气管炎的中医理论提供现代药理学依据。

1 数据来源与方法

1.1 痰热清注射液成分的确定

根据对文献[9-11]的数据挖掘发现，痰热清注射液为经典治疗肺病的中药方剂，其主要成分包含连翘酯苷E(ForsythosideE)、绿原酸(ChlorogenicAcid)、新绿原酸(NeochlorogenicAcid)、隐绿原酸(CryptochlorogenicAcid)、咖啡酸(CaffeicAcid)、野黄芩苷(Scutellarin)、木犀草苷(Luteoloside)、马钱苷(Loganin)、断氧化马钱子苷(Secoxyloganin)、异绿原酸A(3,5-Dicaffeoylquinicacid)、异绿原酸B(4,5-Dicaffeoylquinicacid)、异绿原酸C(3,4-Dicaffeoylquinicacid)、黄芩苷(Baicalin)、千层纸素-7-o-β-葡萄糖醛酸苷(OroxylinAGlucoronide)、白杨素-7-o-β-葡萄糖醛酸苷(Chrysin-7-o-D-glucoronide)、汉黄芩苷(Oroxindin)、胆酸(CholicAcid)、熊去氧胆酸(UrsodeoxycholicAcid)、鹅去氧胆酸(ChenodeoxycholicAcid)、汉黄芩素(Wogonin)，总共20个成分。

1.2 痰热清注射液成分靶点分析

本文利用STITCH作为一个重要的基因与化学相似度数据库，用于确定痰热清注射液中的主要化学成分，STITCH是一个用于预测化学物质与遗传的交互作用的数据库，包括Durg Bank、GLIDA、Matador等人工标注的资料库，还有KEGG、PID等通路途径的资料库、CHEMBL、PDSPKi等都是数据主要来源。其中每个化合物与蛋白互作关系都对应一个分值，代表其相互作用概率或结合亲和力，此外还提供与目标药物相似的化合物及相似分数。首先，在STITCH(V5.0)数据库中输入1.1项中各成分英文名并选择好种属“Homo spaiens”并提交。然后，将结果中“minimum required interaction score”可靠分数设置成0.7(高可信度)，其他参数默认，以此获得符合要求的靶点。

1.3 支气管炎靶点分析

本研究采用5个数据库搜集，分别是TTD、DigSee、pharmGKB、OMIM、GAD，探究疾病与靶点的关系。TTD数据库是全球第一个提供免费药物靶标信息的在线平台，提供目前已知或者处于探索阶段的、具有治疗价值的蛋白或核酸靶点的相关信息，包括靶点相关疾病。介导生物学通路信息，作用靶点的药物信息。将获得的蛋白名称经uniprot转换为对应的基因名称，由数据库TTD(update by 2015)在“Search drugs and targets by disease or ICD identifier”中输入该疾病的英文名称；DigSee是一种涉及到生物活动的基因，该数据库中包含了各种疾病和重大生物事件，如基因表达、点突变等。在数据库DigSee(v2.01)中“disease”搜索框搜索疾病并筛选score≥0.7收集靶点；pharmGKB是药物基因组学信息的中央知识库，药物剂量指南、药物以药物为中心的途径以及基因、药物和疾病之间的关系等过程都包含在内。pharmGKB搜索疾病得到相应文章并收集靶点；在提供相关数据库的OMIM(Updated 2018)数据库中搜索疾病并只收集“*”条目里的靶点，“*”代表的是一个基因；GAD(暂停更新)搜索疾病获得相应靶点。以上疾病所用的英文关键词为“bronchitis”。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用信息(PPI)网络的构建

PPI网络构建在细胞过程中起到关键作用，清楚地描绘了基因与基因之间相互作用关系，提高了在分子水平上对蛋白质功能的理解。为进一步探索药物成分与疾病靶标之间的关系，本研究采用STRING(V10.5)数据库，输入1.2、1.3项中的成分和与疾病有关的靶点，并将其作为“Homo spaiens”提交。在得到的“minimumrequiredinteractionscore”的可靠性得分为0.900(最高可信度)，而其它的参数默认，进而获得成分与靶点间的互作网络。

1.5 筛选核心靶点

Cytoscape可以用来描述大量的边和节点，其中相互作用关系多的节点被认为是核心靶点。利用软件Cytoscape(版本3.8.2)的“merge”工具对1.4项下的痰热清成分、支气管炎的PPI网络取交集，交集之后得到的靶点即认为是痰热清注射液作用于支气管炎的核心靶点。

1.6 GO和KEGG富集分析

为猜测核心靶标在生物代谢及信号通路中的作用，David平台可以从生物通路、GO条目、蛋白-蛋白交互作用、疾病相关性等方面对输入的基因进行广泛的分析。本文以David(V6.8)为基础，对GO生物作用-KEGG信号途径进行了富集。将生成的核心靶点以“gene symbol”的形式上传，并选取对应“Homo spaiens”的背景，按照P-Value值，对富集的生物学进程和信号路径的结果进行排序(P<0.05)。

2 结果

2.1 药物成分及靶点分析

通过对痰热清注射液成分进行了靶点预测，获得了10种满足指标的成分，其中包括胆汁酸、有机酸、类黄酮、环烯醚萜。其中胆汁酸类成分3个：胆酸124个、鹅去氧胆酸123个、熊去氧胆酸38个；有机酸类成分2个：咖啡酸20个、绿原酸10个靶点；黄酮类成分4个：黄芩苷23个、汉黄芩素18个、野黄芩苷4个、木犀草苷3个；环烯醚萜类成分1个：马钱苷1个。整合得到相应靶点共230个。结果见图1。

图1 成分-靶点网络

2.2 支气管炎及靶点分析

通过对TTD、DigSee、pharmGKB、OMIM、GAD五个疾病数据库获得靶点进行整合，共得到支气管炎相关靶点47个，其中TTD得到6个靶点、DigSee得到24个、pharmGKB得到1个、OMIM得到9个、GAD得到8个。具体结果见表1。

表1 支气管炎相关靶点

2.3 痰热清注射液成分、支气管炎靶点PPI结果

痰热清注射液成分靶点经PPI构建后共得到730个靶点，11307条边，其中间接靶点有500个，结果见图2；支气管炎靶点经PPI构建后共得到543个靶点，7488条边，其中间接靶点有496个，结果见图3。图中红色节点是输入的痰热清的成分，支气管炎靶点即直接靶点，绿色是预测出的相互作用间接靶点。节点大小与其degree值成正比。

图2 成分靶点的ppi网络 图3 支气管炎靶点ppi网络

2.4 核心靶点结果

通过PPI网络对成分、疾病靶点进行筛选，最终获得171个靶点。其中包含炎症因子包括白细胞介素(Interleukin，IL)IL6、IL8等和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)。以及成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor，FGF2)，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)，趋化因子受体(C-C chemokine receptor，CCR)CCR1、CCR2等，血清白蛋白(Serum albumin，ALB)，血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，KDR)等主要与调节炎症反应、保护内皮细胞等参与支气管炎的发生发展。具体网络结果见图4。该图中色彩的深度与结点的Degree值的大小是成比例的。

图4 核心靶点网络

2.5 GO和KEGG富集分析

GO生物过程Top30结果如图5所示。其中包括MAPK级联、炎症反应、NF-κB转录因子活性的正调控、NF-κB转录因子活性、一氧化氮的合成等。KEGG信号通路Top30，如图6所示。信号通路主要有：TNF信号通路、NF-κB信号通路、趋化因子信号通路、T细胞受体信号通路等。在该图中，纵轴线为项目名，横轴为“Rich factor”：在不同表达基因中，该项目的基因数量与被标注的基因总数之比。圆点颜色越红代表差异性与显著，大小代表基因数目。

图5 生物过程(GO)气泡图

图6 信号通路(KEGG)气泡图

3 讨论

支气管炎的主要病理变化表现为腺体增生，黏膜上皮细胞变化和支气管壁之间的改变。分泌功能的亢进，有关指标的增加提示炎症的产生，由于炎症的反复发作致使支气管细胞壁伴有充血，水肿甚至是纤维的增生。核心机制为炎症反应、黏液高分泌、气道表面脱水或重塑，各环节间互相联系[12]。

本研究通过对成分靶点和支气管炎的171个核心靶点的GO富集和KEGG通路富集分析显示，痰热清注射液-支气管炎相互作用关系离不开这些细胞因子的调控，如炎症因子，TNF，EGF，FGF，CCR1，CCR2，ALB，KDR等，以及这些信号通路，包括炎症反应，趋化因子信号，T细胞，MAPK级联，NF-kB通路。其中5个靶点是痰热清成分直接作用于支气管炎的，分别是黄芩苷、木犀草苷和熊去氧胆酸的共同靶点一氧化氮合酶(Nitricoxidesynthase，NOS2)；黄芩苷的EGF和细胞色素P450 2E1(CytochromeP450 2E1, CYP2E1)；熊去氧胆酸的白细胞介素-1β(Interleukin-1beta, IL-1β)；鹅去氧胆酸的囊性纤维化跨膜传导调节因子(Cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator，CFTR)。由此可见，炎症反应是支气管发生必经的反应，而痰热清注射液中的有效成分恰好作用于此。NOS2能够产生NO，NO具有双重作用，一方面能增强炎症表达，加重组织损伤[13]，另一方面NO具有舒张血管,有利于肺组织重建的作用[14]。有研究表明，在急性毛性支气管炎患儿中NO含量明显高于缓解期，提示NO在毛性支气管炎患儿中有作用[15]。EGF可在成人中枢神经系统中表达，促进不同的表皮及上皮组织的生长，促进成纤维细胞的增殖[16]。EGF及其受体在支气管炎患者的治病意义被得到充分证明[17]。EGF和IL-1β引发的炎症反应及变态反应中具有重要的调节作用[18]。CYP2E1可以将药物等代谢为活性代谢物，研究发现CYP2E1的多态性变异与儿童复发性肺炎相关[19]。IL-1β诱导前列腺素合成，中性粒细胞和T细胞活化，B细胞活化和抗体产生，以及成纤维细胞增殖和胶原产生，参与调控炎症反应[20]。有证据表明IL-1β和TNF-α会刺激巨噬细胞并刺激支气管上皮细胞，EGF的表达增加发生在慢性支气管炎患者身上[21]。CFTR在上皮离子、水转运和液体稳态的调节中起重要作用，吸烟可以抑制CFTR表达，CFTR功能障碍与慢性支气管炎和呼吸困难独立相关[22-23]。

T淋巴细胞是慢性支气管炎的主要气道细胞，其发生时，气道内的嗜酸粒细胞会增多，并能聚集嗜酸白细胞和T淋巴细胞进入气道[24]。MAPK信号通路在介导炎症反应方面起着重要作用[25]，其中富集的核心靶点转化生长因子(TGF-β)在炎症发生发展方面具有重要作用[26]。在吸烟诱导的慢性支气管炎的大鼠模型中发现，TGF-β信号通路的抑制可以预防慢性支气管炎引起的气道炎症[27]。NF-κB是一种重要的炎症反应活性物质，在炎症反应中起中心作用，通过调控细胞内的细胞因子及趋化因子的表达，促进上皮细胞的增殖[28-29]。TNF主要由巨噬细胞分泌并参与炎症反应，在某些条件下它可以刺激细胞增殖并诱导细胞分化[30]。严重的急性毛细支气管炎症病例中表现出高TNF-α值，在许多文献中都能证明这一点[31]。

支气管炎发病机制复杂，痰热清注射液可能在调节支气管炎症的发生、保护内皮细胞、调节免疫过程中起着重要作用。未来的研究重点可能在于阐明各参与因素之间的关系并深入到基因层面。本研究正是基于网络药理学方法探究痰热清注射液对支气管炎作用的分子机制，为其继续深入研究提供思路和方向。