基于网络药理学探究筋痛灵膏外用治疗肩关节周围炎的作用机制

任涛 张开伟

1贵州中医药大学，贵阳 550025；2贵州中医药大学第一附属医院骨伤科，贵阳 550001

肩关节周围炎是一种以肩部疼痛、关节僵硬和运动功能障碍为主要特征的肩部周围软组织疾病，患者肩部疼痛，夜间疼痛为甚，严重影响患者的生活质量［1-2］。肩关节周围炎的发病率为2%～5%，约占肩部疾病的42%［3-5］。因此，迫切需要找到治疗该病的方法。目前，西医治疗肩关节周围炎的主要方法有口服药物、局部麻醉、局部阻断治疗、物理治疗和手术治疗等［4］。手术治疗适应证有限，费用高，风险大［6］。虽然还有很多其他的治疗方法，但只能暂时缓解症状，远期效果不佳，且西药口服有一定的不良反应［7］。随着中医药的不断发展，其在治疗肩关节周围炎中具有显著优势，膏药不良反应小、使用简便［8］，对治疗肩关节周围炎具有重要的临床意义。

既往研究表明，膏药具有温阳活血的作用，对于寒凝血瘀型肩周炎的止痛效果好［9］。筋痛灵膏是张开伟教授根据贵州中医药大学第一附属医院沈冯君名老中医“以筋为先，筋骨并重，筋病及骨”的学术思想整理而得，其是张开伟教授在临床上长期外用治疗肩关节周围炎、肌筋膜炎的经验用方，由川乌、半夏、天南星、乳香、没药5种药物组成，对肩关节周围炎，肌筋膜炎的临床疗效显著，方中君药为川乌，臣药为天南星，佐药为半夏，使药为乳香、没药，全方具有散寒除湿、舒筋活血、通络止痛的作用。

网络药理学是一门基于疾病基因药物靶标网络的新兴学科，通过网络相互作用研究中医药的基础生物学知识，帮助我们阐明生物分子水平中药有效成分的药理作用机制。本研究基于网络药理学，预测筋痛灵膏治疗肩关节周围炎的药理作用机制，为后期实验研究提供理论依据。

资料与方法

1、数据处理软件与数据库

所用数据库及软件包括：中药系统药理学分析平台（TCMSP）（https：∕∕old.tcmsp-e.com∕tcmsp.php）、Uniprot（http：∕∕www.uniprot.org∕）、GeneCards（https：∕∕www.genecards.org∕）、PharmGkb（https：∕∕www.pharmgkb.org∕）、TTD（http：∕∕db.idrblab.net∕ttd∕）、DrugBank（https：∕∕www.drugbank.ca∕）、OMM（https：∕∕omim.org∕）、Cytoscape（http：∕∕cytoscape.org∕）、STRING（https：∕∕string-db.org∕）、PubChem（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）、RCSB PDB（https：∕∕www.rcsb.org）、OpenBabel软件、R软件、PyMOL、Autodock vina。

2、筋痛灵膏活性成分及其靶点的筛选

筋痛灵膏药物的主要成分通过TCMSP数据库来检索，选择口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为筛选指标。筛选后获取筛选药物有效成分和靶点，去除重复靶点，并在Uniprot数据库查找对应靶点和靶基因名称。

3、肩关节周围炎靶点获取

通过数据库（GeneCard、OMIM、pharmGkb、TTD、DrugBank）检索关键词“periarthritis of shoulder”，获取疾病靶点。然后，整理并删除重复项，运用Venny2.1.0平台得出药物和疾病靶点的交集，从而获得筋痛灵膏治疗肩关节周围炎的作用基因靶点并绘制韦恩图。

4、网络的构建与分析

将药物活性成分和疾病靶点输入到Cytoscape3.7.2软件中来构建复合靶点网络。使用节点和节点之间的连接来分别表示网络中的药物活性成分∕靶标和相互作用。

5、蛋白质相互网络（PPI）的构建

在STRING数据库中输入交集靶标进行PPI数据分析，将物种设置为“人类”，高置信水平设置为0.400。在Cytoscape3.7.2软件中导入tsv格式，然后利用disgenet和CytoNCA插件来鉴定核心基因从而筛选出核心靶标。

6、基因本体论（GO）和京都基因与基因组大百科全书数据库（KEGG）通路富集分析

将交集基因导入metascape，并利用R软件中的Bioconductor包进行GO和KEGG富集分析。

7、分子对接

在PubChem数据库和PDB数据库中分别下载小分子受体2D结构和蛋白受体，通过SailVina平台进行Autodock vina分子对接，并利用Pymol2.3.4可视化处理。

结 果

1、筋痛灵膏活性成分及靶基因

通过检索得到76个筋痛灵膏的活性成分，包括川乌3个，半夏13个，天南星7个，乳香8个，没药45个（表1）。

表1 筋痛灵膏的部分有效成分

2、靶点结果

通过在GeneCard、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank数据库中得到肩周炎相关靶点3 411个，然后，将筋痛灵膏与肩关节周围炎相关靶点通过Venny平台进行交集，得到共有基因121个（图1）。

图1 筋痛灵膏药物和疾病靶点交集基因韦恩图

3、目标网络及分析

活性成分分-靶标相互作用网络由Cytoscape3.7.2软件构建（图2）。圆形节点代表了筋痛灵膏的活性成分，每条边描述了功能成分与靶基因之间的关系。绿色表示没药的活性成分，紫色表示半夏的活性成分，粉红色表示川乌的活性成分。由图2中可以看出，连接到较多的靶标分别是槲皮素（MOL000098）、豆 甾 醇（MOL000449）、β-谷 甾 醇（MOL000358）和黄芩素（MOL002714）。

图2 筋痛灵膏的活性成分-关键靶点网络图

4、PPI网络分析

网络构建和网络拓扑分析，将筋痛灵膏的作用靶点导入Bisogenet中，限定研究物种为“Homo Sapiens”得到蛋白互相关系，并运用Cytoscape软件中的插件CytoNCA，设置DC＞61和BC＞200。并 对degree取2倍 中 位 数 和 其 中Betweenness、Closeness、BC、LAC、CC、NC中位值打分获得核心靶点：JUN（度值52）、ESR1（度值42）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）14（度值24）、MAPK1（度值18）、TP53（度值20）。筛选得到富集程度高的蛋白互作关系，构建PPI核心网络图。见图3。

图3 筋痛灵膏治疗肩关节周围炎蛋白质相互网络图

5、GO和KEGG分析

药物和疾病基因通过R3.7.2软件来进行GO和KEGG功能富集分析。共得到2 272个GO富集结果，包括2 029个生物过程（BP）、60个细胞组分（CC）以及183个分子功能（MF）。BP、CC和MF的前10项分别如图4所示。BP主要富集在异生素刺激的反应、伤口愈合、细菌来源分子的反应和氧气水平的反应等方面。CC主要涉及到膜微区和膜筏。MF主要体现在DNA结合转录因子结合和泛素样蛋白连接酶结合等方面。采用KEGG信号通路分析方法来确定与筋痛灵膏治疗肩关节周围炎相关的信号通路，共筛选出171个KEGG富集通路。根据P＜0.05，绘制了前30条KEGG通路结果的柱状图（图5）。在KEGG通路中，筋痛灵膏治疗肩关节周围炎主要富集在白细胞介素（IL）17信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等（图6）。

图5 基因本体论（GO）功能富集分析结果

图6 京都基因与基因组大百科全书数据库（KEGG）通路富集分析结果

6、分子对接结果

通过筛选出来的核心靶点蛋白（JUN、TP53、RELA、MAPK14、MAPK1）和对应的活性成分进行分子对接，以结合能≤-5.0 kJ∕mol作为标准。分子对接结果发现核心靶点蛋白与活性成分对接后结合能均小于-5.0 kJ∕mol（图7），表明关键活性成分与核心靶点蛋白之间具有强烈的结合活性。此外，本研究还发现槲皮素（MOL000098）与JUN结合能力最好，为-9.2 kJ∕mol。

图7 分子对接图（A为JUN—槲皮素，B为TP53—黄芩素，C为TP53—槲皮素，D为MAPK14—牵牛花色素，E为MAPK1—槲皮素，F为RELA—槲皮素）

讨 论

肩关节周围炎是一种发病率高且疼痛大的疾病。目前，肩关节周围炎防治方法多种多样，非甾体类抗炎药物、关节镜松解、推拿疗法、中药内服等，其中膏药外敷也是治疗肩关节周围炎的重要手段［10-12］。然而，膏药治疗肩关节周围炎的作用机制尚不清楚。网络药理学为研究中草药的复杂药理机制提供了新的方法。本研究通过网络药理学和分子对接技术来探索筋通灵膏治疗肩关节周围炎的作用机理。筋痛灵膏的有效成分和作用靶点通过TCMSP获得，其中潜在有效成分53个，作用靶标24个。根据degree值得到槲皮素、谷甾醇、β-谷甾醇、黄芩素连接比较多的靶点。

槲皮素能抑制IL-17和TNF-α，提高免疫功能，达到消炎和镇痛的作用［13］。据报道，槲皮素能清除缺氧，提高p-MAPK蛋白表达水平，减少缺氧对细胞的损伤［14］。β-谷甾醇具有抗炎作用［15］。有科学研究证实β-谷甾醇有抑制破骨细胞，保护成骨细胞，保护关节软骨的功能［16］，而豆甾醇则有消炎、镇痛的功效［17］。据报道豆甾醇能够对小鼠疼痛产生镇痛的效果［18］。Ahmad Khan等［19］研究表明豆甾醇通过抑制p38MAPK和NFkBp6通路，防治关节炎的主要药物。黄芩素具有显著抗炎效果，可以减少IL-1β、IL-6、TNF-ɑ，抑制细胞凋亡，改善关节软骨的作用［20］。这些结果表明核心成分在治疗肩关节周围炎中起重要作用。

通过PPI筛选得到的核心靶点（TP53、ESR1、JUN、MAPK1）是治疗肩关节周围炎的关键靶点。TP53与细胞免疫相关，对人体免疫应答能力有重要的影响［21］。TP53可以通过调节细胞分裂和增殖来影响细胞衰老和凋亡［22-23］。MAPK参加了细胞因子与受体结合后调控转录的进程，对生物细胞的繁殖、分化、应激适应和炎性反应具有重要的调控作用［24］。JUN作为一种原癌基因，它编码的c-JUN蛋白是转录因子AP-1家族的重要一员，在控制细菌的增殖、分化、侵染和凋亡方面起着关键作用［25-26］。

KEGG分析结果显示，IL-17信号通路、TNF信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等与肩关节周围炎的防治效果有关。而AGE-RAGE通路也与炎症的产生相关，它能够升高MAPK磷酸化作用水平，从而提高了TNF-α、IL-1和IL-6等炎症因子的表达［27］。IL-17为IL的一种，参与炎性反应。有研究表明，IL-17是关节炎发生的重要因素，IL-17的减少可缓解人体软骨破坏抑制炎性因子的表现［28］。TNF信号通路既有抗肿瘤作用，又有炎症介质功能。TNF-α是肩袖损伤患者的磨损肌腱组织和肩峰下滑囊组织中常见的炎症细胞因子［29］。这些通路与人体免疫相关，可能是筋痛灵膏通过这些通路调节炎性反应，从而达到治疗肩关节周围炎的作用。

本研究对筋痛灵膏的核心靶点蛋白（JUN、TP53、RELA、MAPK14、MAPK1）与对应的活性成分（槲皮素、β-谷甾醇、谷甾醇和黄芩素）进行分子对接，结果显示，核心靶点蛋白与活性成分对接的亲和力小于-5.0 kJ∕mol，表明关键活性成分与核心靶点蛋白之间具有较好结合活性。此外，本研究还发槲皮素与JUN结合能力最好，为-9.2 kJ∕mol。分子对接表明筋痛灵膏可能通过靶向这些核心靶点蛋白在肩关节周围炎中发挥作用。

综上所述，本研究发现筋痛灵膏通过槲皮素、谷甾醇等化学成分作用于JUN、TP53、RELA等关键靶点，在IL-17、TNF等信号通路下调节免疫力，减低炎性反应，从而达到防治肩关节周围炎的效果，为进一步实验研究奠定基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突