左金丸组分中药配伍组分制备工艺研究

刘斯琪，王如峰

左金丸组分中药配伍组分制备工艺研究

刘斯琪，王如峰*

北京中医药大学生命科学学院，北京 102488

建立左金丸组分中药配伍组分制备工艺并对所得组分的主要成分进行定性和定量表征。通过正交试验设计考察最佳提取溶剂、提取时间和提取次数；以总生物碱含量为指标考察吸附树脂类型、最佳上样质量浓度、上样量、径高比和吸附时间；采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）和UPLC法对组分中的主要成分进行定性和定量分析。所选工艺流程为10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h；提取物用AB-8大孔树脂柱纯化，最佳上样质量浓度为0.5 g/mL，上样量为0.12个柱体积（BV），径高比为1∶12，吸附时间为1 h；洗脱溶剂依次为28 BV 40%乙醇，16 BV 60%乙醇，13 BV 95%乙醇。上述工艺流程得到3个组分，即C40、C60和C95组分。从C40组分中指认了31个成分，主要为黄连生物碱类，其中盐酸小檗碱含量最高（20.15%）；从C60组分中指认了32个成分，主要为吴茱萸柠檬苦素类，其中柠檬苦素含量最高（15.40%）；从C95组分指认了36个成分，主要为吴茱萸生物碱类，其中吴茱萸次碱含量最高（4.14%）。建立的左金丸组分中药配伍组分制备工艺重复性好，所得组分活性成分含量高，质量稳定，为进一步成药性研究和组分中药研制奠定基础。

左金丸；黄连；吴茱萸；组分中药；UPLC-MS/MS；生物碱；盐酸小檗碱；柠檬苦素；吴茱萸次碱

左金丸为中医经典名方，记载于《丹溪心法·火六》卷一，由黄连和吴茱萸以6∶1比例配伍而成。方中黄连解除肝火旺盛，配以吴茱萸调和药性，两者合降胃气，对胃炎、胃溃疡疗效显著。左金丸的主要活性成分为生物碱类成分[1]，左金丸总生物碱有治疗胃溃疡的作用[2]。其中，来自黄连的生物碱为异喹啉类，包括小檗碱、表小檗碱、黄连碱、药根碱等，有消炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多种生物活性[3]；来自吴茱萸的生物碱包括吲哚类和喹诺酮类成分，有抗菌[4]、抗炎、保护心血管等作用[5-6]。除此之外，左金丸还含有来自吴茱萸的柠檬苦素类成分[7]。

左金丸化学成分相对明确，通过对主成分生物碱类进行富集除杂有望开发成组分中药。组分中药是在中医药理论指导下，遵循方剂配伍原则，采用现代药物开发方法和技术研制而成的现代中药[8]。组分中药的物质基础和作用机制相对清楚，不仅保留了中药方剂的优势，而且便于制剂，能实现工业化大规模重复制备并易于质量控制，是中药现代化的重要体现形式[9]。为了给后续左金丸主要组分的成药性研究提供参考，本研究建立了左金丸总生物碱组分的高效制备工艺，并对获得的配伍组分主要成分进行了定性定量表征，为左金丸的进一步开发利用奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-30AD型超高效液相色谱仪，日本Shimadzhu公司；UPLC-QExactive-MS型超高效液相色谱串联质谱仪，美国Thermo公司；Shim-pack GIST C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2 μm），日本Shimadzhu公司。

1.2 材料

黄连饮片（产地重庆石柱，批号Ⅲ-20190513- YSZ-YC01）、吴茱萸饮片（产地江西九江，批号WZY-20190513-CJJ-YC01）由北京盈科瑞创新医药股份有限公司提供，经北京中医药大学王如峰教授鉴定为毛茛科黄连属植物黄连Franch.的干燥根茎和芸香科吴茱萸属植物疏毛吴茱萸(Juss.) Benth. var.(Dode) Huang的干燥近成熟果实；AB-8型大孔树脂购自高华伟业食品添加剂有限公司；D151型弱酸性阳离子交换树脂购自郑州和成新材料科技有限公司；95%乙醇购自北京虹湖联合化工产品有限公司；分析纯甲酸和色谱纯乙腈、甲醇为Thermo Fisher Scientific公司。对照品格兰地新（批号M08D8S50327）、黄连碱（批号P05M9F55053）、药根碱（批号Z11M8S35794）、掌叶防己碱（批号W15J9Z52995）、盐酸小檗碱（批号Y18N8S48598）由上海源叶生物科技有限公司提供；对照品去氢吴茱萸碱（批号PRF9121743）、吴茱萸碱（批号PRF9121741）、吴茱萸次碱（批号PRF9121742）、吴茱萸苦素（批号PRF8082221）购自成都普瑞法科技开发有限公司；对照品非洲防己碱（批号RFS- F02902003011）、氧化小檗碱（批号RFS-Y16702008 021）、四氢小檗碱（批号RFS-S08901905023）、柠檬苦素（批号RFS-N00611812016）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；对照品7β-羟基吴茱萸次碱（批号ML-01047）购自无锡鸣鹭医药科技有限公司；对照品表小檗碱（批号180309）购自北京四面体生物科技有限公司；对照品二氢吴茱萸新碱（批号181209）购自成都植标化纯生物技术有限公司；所有对照品质量分数均＞98%。

2 方法与结果

2.1 制备工艺研究

2.1.1 提取工艺考察 称取黄连18.0 g和吴茱萸粉末3.0 g（过50目筛），混合后分别加入10倍量纯水及30%、50%、70%、80%、95%乙醇回流提取2次，每次1 h，每种溶剂重复3次。提取液合并后减压浓缩，冷冻干燥。取冷冻干燥的提取物，通过酸性染料比色法[10]测定总生物碱含量，选择最优提取溶剂。由表1中总生物碱含量可知，最优提取溶剂为70%乙醇。

表1 不同溶剂总生物碱提取结果(, n = 3)

Table 1 Extraction of total alkaloids with different solvents (, n = 3)

提取溶剂提取物量/g生物碱量/g质量分数/%提取率/% 水5.936±0.0821.568±0.09126.417.47 30%乙醇6.190±0.1631.847±0.07829.848.79 50%乙醇6.458±0.2162.183±0.13033.8110.40 70%乙醇5.982±0.0782.274±0.00638.0210.83 80%乙醇5.547±0.0272.201±0.08339.6710.48 95%乙醇4.225±0.0191.703±0.01940.308.11

本研究具有3个主要考察因素，参考已有文献报道[10]分别选择合适的水平，采用L9(34)正交试验表设计正交试验（表2），采用70%乙醇，以不同提取时间、提取次数和溶剂用量回流提取。正交试验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 L(3)正交试验设计与结果

Table 2 Designandresults of L(3) orthogonal experiment

试验号A/hB/次C/倍D (误差)总生物碱提取率/% 11.0 (1)1 (1)8 (1)(1)7.66 21.0 (1)2 (2)10 (2)(2)10.12 31.0 (1)3 (3)12 (3)(3)11.79 41.5 (2)1 (1)10 (2)(3)8.26 51.5 (2)2 (2)12 (3)(1)10.23 61.5 (2)3 (3)8 (1)(2)11.29 72.0 (3)1 (1)12 (3)(2)9.40 82.0 (3)2 (2)8 (1)(3)9.85 92.0 (3)3 (3)10 (2)(1)11.44 K129.5725.3228.8029.33 K229.7830.2029.8230.81 K330.6934.5231.4229.90 R1.129.202.621.48

表3 方差分析结果

Table 3 Results of variance analysis

误差来源离差平方和自由度均方F值显著性 A0.236 320.118 10.636 1 B14.124 127.062 038.020 2P＜0.05 C1.162 820.581 43.130 0 D (误差)0.371 520.185 7

0.05(2, 2)＝19.000.01(2, 2)＝99.00

从上述结果可以看出，A3＞A2＞A1、B3＞B2＞B1、C3＞C2＞C1，最优工艺为A3B3C3，即12倍量70%乙醇回流提取3次，每次2.0 h。其中因素B为显著性影响因素，其极差和值都明显高于其他2个因素，而A和C为不显著性因素，对总生物碱提取效率影响较小。对最优工艺进行验证，发现A3B3C3的总生物碱提取率为11.67%（＝3）。

2.1.2 色谱填料考察 取最优提取溶剂提取液，减压浓缩后冷冻干燥，测定总生物碱含量。根据已有关于左金丸及组方药化学成分制备的文献报道，选择AB-8型大孔树脂[10]和D151型弱酸性阳离子交换树脂[11-13]作为考察对象。精密称取0.70、0.80、0.70 g AB-8型大孔吸附树脂和3份1.0 g D151型离子交换树脂，分别加入80 mL药液（总生物碱量0.56 mg/mL），25 ℃、150 r/min振摇吸附12 h，检测上清液总生物碱含量。弃去全部上清后用纯水洗涤树脂2次，AB-8大孔树脂中加入70%乙醇，D151离子交换树脂中加入等量含10%冰醋酸的70%乙醇溶液，25 ℃、150 r/min振摇解吸附12 h，取上清液测定总生物碱含量。根据公式确定2种树脂的吸附能力。

吸附量＝(0－1)/

吸附率＝(0－1)/0

解吸量＝2/

解吸率＝2/(0－1)

转移率＝吸附率×洗脱率

为树脂质量，0为吸附开始时上清中生物碱含量，1为吸附完成后上清液中生物碱含量，0为吸附开始时上清液中生物碱含量，1为吸附完成后上清液中生物碱含量，2为洗脱完成后上清液中生物碱含量

2种树脂的吸附量、吸附率、解吸量、解吸率结果如表4所示。从单位质量吸附能力看，AB-8型大孔树脂远高于D151型离子交换树脂，前者的解吸附能力也明显强于后者，因此，选择AB-8型大孔树脂。

表4 AB-8及D151树脂吸附-解吸情况(, n = 3)

Table 4 Adsorption-desorption of AB-8 and D151 resins (, n = 3)

树脂类型吸附量/(mg∙g−1)吸附率/%解吸量/(mg∙g−1)解吸率/% AB-858.19±4.0595.26±0.7453.74±4.1092.32±0.66 D15143.69±0.1497.89±0.3039.81±0.9090.98±2.18

2.1.3 色谱参数考察 取AB-8型大孔树脂进行单因素考察：考察上样质量浓度时设定大孔树脂径高比为1∶10，设置参数为生药0.3、0.5、0.7 g/mL；考察径高比时设定上样质量浓度为生药0.5 g/mL，设置参数为1∶10、1∶12、1∶14；考察上样体积时设定上样质量浓度为生药0.5 g/mL，径高比1∶12，设置参数为0.04、0.08、0.12、0.16个柱体积（BV）；考察吸附时间时设定上样质量浓度为生药0.5 g/mL，径高比1∶12，上样体积0.12 BV，设置参数为5、15、30 min及1、3、12 h。药液均按照相同体积流量上样，出现碘化铋钾阳性反应时停止，计算上样生物碱总量（1）。用水以相同体积流量洗脱至Molish反应阴性，计算水洗脱生物碱量（2）。最后用70%乙醇洗脱至碘化铋钾反应阴性，计算洗脱下的生物碱含量（3）。每组实验重复3次。根据公式计算吸附-洗脱率，确定最优上样方法。结果见表5～8。

吸附-洗脱率＝3/(1－2)

根据上述实验结果（表5～8），上样质量浓度与径高比均选择吸附-洗脱率较高的生药0.5 g/mL和1∶12。考虑到按照0.16 BV上样会导致泄露，因此，上样体积选择吸附-洗脱率相对较高的0.12 BV。吸附时间考察发现1 h后总生物碱的吸附基本饱和，因此选择1 h作为吸附时间。工艺考察结果确定工艺流程为AB-8型大孔树脂径高比1∶12，左金丸提取液生药0.5 g/mL上样0.12 BV，吸附1 h后分别采用28 BV 40%乙醇、16 BV 60%乙醇、13 BV 95%乙醇洗脱。采用不同体积分数的乙醇进行分段洗脱，HPLC动态检测生物碱含量变化，确定梯度洗脱溶剂为40%、60%、95%乙醇。按照所得最优工艺流程进行组分制备，将各组分收集后减压浓缩，冷冻干燥后测定总生物碱含量，分别得到C40（40%乙醇洗脱）、C60（60%乙醇洗脱）、C95（95%乙醇洗脱）组分。工艺重复3次进行验证，结果如表9所示。由表9可知，C40组分的生物碱质量分数为61.13%，转移率高达70%以上；C60组分和C95组分的生物碱质量分数分别为7.90%、11.19%。3次重复实验结果平行性良好。

表5 上样质量浓度考察结果(, n = 3)

Table 5 Results of loading concentrationinvestigation (, n = 3)

上样质量浓度/(g∙mL−1)吸附-洗脱率/% 0.362.35±0.69 0.583.73±3.73 0.772.53±1.07

表6 径高比考察结果(, n = 3)

Table 6 Results of diameter-height ratioinvestigation (, n = 3)

径高比吸附-洗脱率/% 1∶1074.41±6.34 1∶1279.40±1.97 1∶1477.78±3.89

表7 上样体积考察结果(, n = 3)

Table 7 Results of loading quantityinvestigation (, n = 3)

上样体积/BV吸附-洗脱率/%上样体积/BV吸附-洗脱率/% 0.0457.02±2.230.1264.34±0.94 0.0865.18±4.530.1673.69±8.07

表8 吸附时间考察结果(, n = 3)

Table 8 Results of adsorption timeinvestigation (, n = 3)

吸附时间/min总生物碱/μg吸附时间/h总生物碱/μg 5437.12±50.77194.53±4.70 15158.00±22.01389.84±5.87 30120.23±22.871287.45±17.70

表9 工艺验证结果

Table 9 Results of process validation

组分生物碱质量/mg (质量分数/%)转移率/% 123平均值 C401 461.30 (59.80)1 476.80 (65.46)1 531.10 (58.23)1 489.73 (61.13)70.05 C6041.80 (9.58)32.90 (10.21)43.70 (4.55)39.47 (7.90)0.24 C9515.10 (10.26)16.10 (11.04)16.70 (12.19)15.97 (11.19)0.14

2.2 工艺组分主要成分分析

2.2.1 定性分析 将C40、C60、C95组分分别定容至50、10、10 mL，甲醇稀释后0.22 μm滤膜滤过，进行UPLC-MS/MS分析。流动相为0.05%甲酸水溶液和乙腈，体积流量为0.3 mL/min，进样体积为5 μL，柱温35 ℃。C40组分洗脱梯度为0～57 min，5%～9.7%乙腈；57～100 min，9.7%～17%乙腈；100～110 min，17%乙腈；110～140 min，17%～100%乙腈；140～141 min，100%乙腈；141～145 min，100%～5%乙腈；145～150 min，5%乙腈。C60组分洗脱梯度为0～19.5 min，5%～23%乙腈；19.5～40 min，23%～40%乙腈；40～50 min，40%～100%乙腈；50～51 min，100%乙腈；51～55 min，100%～5%乙腈；55～60 min，5%乙腈。C95组分洗脱梯度为0～24 min，5%～22.6%乙腈；24～27 min，22.6%～23.6%乙腈；27～30 min，23.6%～24%乙腈；30～31 min，24%～29%乙腈；31～67 min，29%乙腈；67～74 min，29%～40%乙腈；74～100 min，40%～100%乙腈；100～101 min，100%乙腈；101～105 min，100%～5%乙腈；105～110 min，5%乙腈。质谱采用电喷雾离子源，分别进行正离子和负离子模式扫描，扫描碎片质量范围为100～1000，分辨率为70 000。碎裂电压为3500 V，鞘气流量为17 L/min，辅助气流量为5.7 L/min，毛细管温度为320 ℃。根据总离子流图和二级离子流图，结合文献报道，采用Xcalibur软件（误差≤5×10−6）分析碎片信息，推测化学成分。

从3个组分中共指认了80个化合物。从C40组分指认了31个成分，主要为黄连的生物碱成分；从C60组分指认了32个成分，主要为柠檬苦素类成分和部分生物碱成分；从C95组分指认了36个成分，主要为吴茱萸的吲哚类和喹诺酮类生物碱。总离子流图如图1所示，具体结果如表10所示。

2.2.2 定量分析 将C40、C60、C95组分分别定容至50、10、10 mL，甲醇稀释后0.22 μm滤膜滤过，进行UPLC分析（图2）。C40和C95组分流动相由0.05%甲酸水溶液和乙腈组成，C60组分流动相由0.05%磷酸水溶液和乙腈组成。体积流量为0.3 mL/min，进样体积为3 μL，柱温35 ℃。C40组分洗脱梯度为0～57 min，5%～9.7%乙腈；57～92 min，9.7%～14%乙腈；92～100 min，14%～17%乙腈；100～140 min，17%乙腈；140～150 min，17%～100%乙腈；150～151 min，100%乙腈；151～160 min，100%～5%乙腈；160～165 min，5%乙腈；检测波长为327 nm；C60组分洗脱梯度为0～19.5 min，5%～23%乙腈；19.5～37.6 min，23%～28.6%乙腈；37.6～43.5 min，28.6%乙腈；43.5～54.5 min，28.6～33%乙腈；54.5～74.5 min，33%～43%乙腈；74.5～90 min，43%～100%乙腈；90～91 min，100%乙腈；91～95 min，100%～5%乙腈；95～100 min，5%乙腈；检测波长为210 nm；C95组分洗脱梯度为0～24 min，5%～22.6%乙腈；24～27 min，22.6%～23.6%乙腈；27～30 min，23.6%～24%乙腈；30～31 min，24%～29%乙腈；31～67 min，29%乙腈；67～74 min，29%～40%乙腈；74～100 min，40%～100%乙腈；100～101 min，100%乙腈；101～105 min，100%～5%乙腈；105～110 min，5%乙腈；检测波长为327 nm和240 nm[22-23]。参照《中国药典》2020年版[24]规定进行方法学考察试验。精密称取格兰地新、去氢吴茱萸碱、黄连碱、表小檗碱、非洲防己碱、药根碱、盐酸小檗碱、掌叶防己碱、四氢小檗碱、吴茱萸苦素、柠檬苦素、吴茱萸碱、7β-羟基吴茱萸次碱、氧化小檗碱、吴茱萸次碱、二氢吴茱萸新碱对照品适量，用甲醇定容至1.0 mg/mL，取适量对照品溶液进行梯度稀释，得混合对照品溶液。以质量浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（）绘制标准曲线，检测下限为信噪比（/）＝3，定量下限为/＝10。在检测质量浓度范围内，所有化合物的线性关系均良好（≥0.999 3）。回归方程、值、线性范围、检测下限和定量下限如表11所示。

A-C40组分正离子模式 B-C40组分负离子模式 C-C60组分正离子模式 D-C60组分负离子模式 E-C95组分正离子模式 F-C95组分负离子模式

表10 工艺组分主要成分定性分析结果

Table 10 Results of qualitative analysis of main compounds in each component

组分化合物分子式tR/minm/z模式二级离子碎片 (m/z) C40盐酸小檗碱[14]C20H18NO4+100.14336.121 8正320.090 91, 306.075 32, 292.096 04, 278.080 81 C40格兰地新[14]C19H16NO4+70.72322.106 3正307.083 07, 279.088 32 C40去氢吴茱萸碱[14]C19H16N3O+74.62302.127 7正286.096 50, 258.130 75 C40黄连碱[14]C19H14NO4+80.56320.090 5正292.095 95, 277.072 66, 262.085 27 C40表小檗碱[14]C20H18NO4+85.84336.121 9正320.091 00, 292.096 25 C40非洲防己碱[14]C20H20NO4+87.90338.141 6正323.118 01, 308.094 36, 293.070 89, 280.464 94 C40药根碱[14]C20H20NO4+90.07338.137 5正323.114 26, 322.106 45, 308.090 67, 294.111 63 C40掌叶防己碱[14]C21H22NO4+104.53352.153 3正336.122 10, 322.106 57, 308.127 32, 294.111 63 C40甲基黄连碱[15]C20H15NO495.16334.106 2正304.096 19 C402-羟基药根碱[14]C19H18NO4+69.34324.121 7正308.090 91, 294.075 23, 280.096 10 C4013-甲基小檗碱[14]C21H20NO4+97.51350.137 6正320.091 03, 306.111 60 C40苹果酸[16]C4H6O50.86133.014 8负115.004 13, 71.013 73 C40柠檬酸[17]C6H8O70.94190.929 2负154.999 42, 111.009 18, 85.029 55 C40咖啡酰葡萄糖酸[17]C15H18O101.11357.063 5负195.052 02, 179.036 01, 135.045 82 C40异柠檬酸[17]C6H8O71.35190.929 2负154.999 37, 111.009 14, 85.029 51 C40腺苷[18]C10H13N5O41.61268.103 2正136.061 49 C40苯丙氨酸[18]C9H11NO22.63166.085 8正120.080 67, 102.970 41 C40迷迭香酸[18]C18H16O83.04359.100 2负197.046 46, 179.035 81, 135.045 76, 123.045 68 C40丹参素[19]C9H10O53.06197.046 5负179.035 81, 135.045 72, 123.045 62 C40香树素-7-O-β-D-葡萄糖苷[17]C21H22O113.06449.095 8负286.942 87, 268.977 08 C404-O-β-D-葡萄糖基香草醇[17]C14H20O84.28315.110 0负153.056 44 C40原儿茶酸[18,20]C7H6O44.48153.020 0负109.029 85, 91.019 14, 81.034 55 C40L-色氨酸[19]C11H12N2O25.34203.083 6负159.093 48, 142.066 80, 116.050 98 C40原儿茶醛[18,20]C7H6O36.44137.025 0负119.014 11, 108.021 99, 81.034 52 C40阿魏酰奎宁酸[17]C17H20O911.56367.105 3负193.051 44, 191.056 96 C40绿原酸[17]C16H18O912.79353.089 5负191.056 96, 179.035 80, 161.025 18 C40姜黄素[18]C21H20O613.66369.116 6正177.054 15, 145.028 06, 117.033 45, 89.038 86 C40阿魏酰葡萄糖酸[17]C16H20O1026.57371.100 3负195.052 05, 193.051 62, 134.037 92 C40二氢吴茱萸定[14]C18H22NO5+89.55332.138 3正317.115 05, 302.091 58 C40wuchuyuamide Ⅱ[17]C19H17N3O3106.16336.121 8正318.075 62, 304.096 50, 161.141 33 C40吴茱萸苦素[17]C26H30O9118.93485.184 1负423.183 65, 397.167 79, 383.152 50 C60柠檬苦素[17]C26H30O834.21471.199 9正427.210 30, 425.194 52, 161.059 25 C60吴茱萸苦素[17]C26H30O931.51485.183 2负423.182 80, 397.166 96, 383.151 31 C606β-乙酰氧基-5-表柠檬苦素[17]C28H32O1037.52527.194 0负485.183 41, 467.172 49, 383.151 15 C60吴茱萸内酯醇[17]C26H28O935.94483.167 6负421.167 18, 395.151 49, 161.061 29 C60石虎柠檬素A[17]C26H30O1031.11501.178 4负471.167 48, 411.146 24, 235.876 02 C60吴茱萸苦素乙酸酯[17]C28H32O1023.86529.205 1正485.215 39, 469.184 48, 451.173 77, 425.194 49, 393.131 99, 367.152 92 C602-羟基药根碱[14]C19H18NO4+15.95324.121 8正308.090 70, 294.075 13, 280.096 01, 266.081 21 C60甲基黄连碱[15]C20H15NO421.14334.106 0正304.096 01 C60γ-氨基丁酸[18]C4H9NO20.76104.107 1正87.044 33, 69.034 00

续表10

续表10

组分化合物分子式tR/minm/z模式二级离子碎片 (m/z) C951-甲基-2-[(4Z,7Z)-十三碳-4,7-二烯基]-4(1H)-喹诺酮[17]C23H31NO85.43338.246 6正186.090 94, 173.083 15 C951-甲基-2-正十一烷基-4(1H)-喹诺酮[17]C21H31NO86.20314.246 8正186.091 02, 173.083 39 C951-甲基-2-[(6Z,9Z,12E)-十五碳-6,9,12-三烯基]-4(1H)-喹诺酮[17]C25H33NO86.52364.262 5正186.090 96, 173.083 21 C95吴茱萸卡品碱[17]C23H33NO87.29340.262 5正256.169 07, 242.153 27, 228.137 60, 200.106 40, 186.090 90, 173.083 15 C952-十三烷基-4(1H)-喹诺酮[17]C22H33NO88.11328.262 4正186.091 09, 173.083 15 C951-甲基-2-[(6Z,9Z)-十五碳-6,9-二烯基]-4(1H)-喹诺酮[17]C25H35NO88.63366.278 2正228.137 85, 186.090 91, 173.083 16 C95二氢吴茱萸卡品碱[17]C23H35NO90.13342.278 2正186.091 03, 173.083 25 C951-甲基-2-[(Z)-十五碳-10-烯基]-4(1H)-喹诺酮[17]C25H37NO90.98368.293 9正173.083 28, 186.090 82 C95格罗苦素甲或异构体[18]C26H30O1026.80501.179 0负457.189 30, 413.199 13 C95格罗苦素甲或异构体[18]C26H30O1027.98501.178 9负457.189 30, 413.199 28 C95wuchuyuamide Ⅱ[17]C19H17N3O329.63336.133 1正318.122 89, 161.070 60, 134.059 78 C95euodirutaecin A[17]C26H28O1129.85515.158 3负471.168 40, 383.152 40, 146.918 72 C95euodirutaecin B[17]C26H28O1130.83515.158 3负471.168 30, 383.153 99 C95吴茱萸苦素[17]C26H30O938.71485.184 0负423.183 62, 397.168 03, 383.152 22 C95吴茱萸内酯醇[17]C26H28O950.96483.168 3负421.167 97, 395.152 44, 161.061 65 C95吴茱萸酰胺[17]C19H21N3O53.22308.174 7正134.059 81 C95吴茱萸苦素乙酸酯[17]C28H32O1060.98527.194 6负485.183 87, 467.173 25, 383.152 01 C956-β-乙酰氧基-5-表柠檬苦素[17]C28H32O1064.78527.194 8负485.184 20, 467.173 95, 383.151 89

A-C40组分 B-C40对照品 C-C60组分 D-C60对照品 E-C95组分 F-C95对照品 1-格兰地新 2-去氢吴茱萸碱 3-黄连碱 4-表小檗碱 5-非洲防己碱 6-药根碱 7-盐酸小檗碱 8-掌叶防己碱 9-去氢吴茱萸碱 10-四氢小檗碱 11-吴茱萸苦素 12-柠檬苦素 13-吴茱萸碱 14-去氢吴茱萸碱 15-7β-羟基吴茱萸次碱 16-氧化小檗碱 17-吴茱萸碱 18-吴茱萸次碱 19-二氢吴茱萸新碱

表11 化合物回归方程、检测下限及定量下限

Table 11 Regression equation, lower limit of detection and quantification of compounds

组分化合物回归方程r线性范围/(μg∙mL−1)检测下限/(μg∙mL−1)定量下限/(μg∙mL−1) C40格兰地新Y＝10 117 X－1 521.80.999 82～500.180.58 去氢吴茱萸碱Y＝9 775 X－5 061.80.999 51～200.200.66 黄连碱Y＝10 228 X－3 765.80.999 31～200.180.60 表小檗碱Y＝19 014 X－1 109.90.999 71～200.070.24 非洲防己碱Y＝21 611 X－4 192.50.999 61～200.060.21 药根碱Y＝20 815 X－5 620.30.999 71～200.070.24 盐酸小檗碱Y＝22 361 X＋2 254.50.999 41～200.120.40 掌叶防己碱Y＝21 499 X－46480.999 31～200.130.42 C60去氢吴茱萸碱Y＝29 850 X＋2 890.10.999 90.5～500.020.06 四氢小檗碱Y＝55 653 X＋1 618.20.999 90.2～200.010.03 吴茱萸苦素Y＝3 442.4 X－351.020.999 91～500.220.74 柠檬苦素Y＝3 849.4 X－2 366.60.999 72～1000.160.53 吴茱萸碱Y＝41 303 X－1 249.30.999 90.1～500.0040.014 C95去氢吴茱萸碱Y＝12 111 X＋82.4930.999 91～200.050.17 7β-羟基吴茱萸次碱Y＝17 162 X－2 116.90.999 91～200.120.40 氧化小檗碱Y＝19 842 X－23140.999 91～200.100.32 吴茱萸碱Y＝20 749 X－2 555.50.999 91～200.080.27 吴茱萸次碱Y＝31 707 X－1 453.20.999 92～500.040.12 二氢吴茱萸新碱Y＝9 219.5 X－54.690.999 91～200.060.21

2.2.3 方法学考察

（1）精密度试验：取混合对照品溶液，连续进样6次，根据标准曲线求得质量浓度，计算其RSD值，得日内精密度结果。连续6 d分析同一混合对照品溶液，根据标准曲线求得质量浓度，计算其RSD值，得日间精密度。结果日内和日间精密度的RSD分别为0.410 4%～1.777 5%和0.194 4%～ 1.881 4%，说明仪器精密度良好。

（2）重复性试验：按照“2.2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进行UPLC检测，根据标准曲线和峰面积求得浓度，计算RSD值。RSD为0.313 0%～1.854 0%，说明方法重复性良好。

（3）稳定性试验：取同一份供试品溶液，在制备后0、2、4、8、12、24 h检测，根据标准曲线求得质量浓度，计算RSD值。24 h稳定性试验的RSD为0.407 3%～1.899 9%，说明样品稳定。

（4）加样回收率试验：取各成分质量浓度已知的供试品溶液6份，按照供试品中各成分含量的50%～150%向其中精密加入已知质量浓度的对照品溶液，根据标准曲线求得质量浓度，得总检测量。按照公式加样回收率＝(检测量－初始量)/加入量计算各成分回收百分比和RSD值。结果得加样回收率为98.37%～101.57%，RSD为0.515 9%～1.937 0%（表12），符合检测要求。

2.2.4 样品测定 3个工艺组分中主要生物碱成分的含量测定结果见表13。从表13中可知，C40组分中含量最高的成分为盐酸小檗碱，其次为黄连碱、掌叶防己碱和表小檗碱；C60组分中柠檬苦素含量最高，与吴茱萸苦素同为三萜苦素类成分，二者相加含量远高于其他成分；C95组分中吴茱萸碱和吴茱萸次碱是主要成分，二者相加占该组分生物碱总量的55%以上。

表12 加样回收率结果

Table 12 Results of recovery test

组分化合物初始量/μg加入量/μg检测量/μg回收率/%RSD/%组分化合物初始量/μg加入量/μg检测量/μg回收率/%RSD/% C40格兰地新2.382.204.58±0.0399.891.230 9C60吴茱萸苦素6.909.5016.44±0.12100.431.248 0 去氢吴茱萸碱0.870.841.71±0.01100.541.482 9 柠檬苦素21.7129.2950.55±0.6898.781.905 3 黄连碱2.522.314.86±0.03101.211.343 5 吴茱萸碱0.310.390.71±0.01101.531.937 0 表小檗碱1.040.951.99±0.0199.711.557 4C95去氢吴茱萸碱3.351.955.28±0.0499.911.241 2 非洲防己碱0.730.651.39±0.01100.901.675 9 7β-羟基吴茱萸次碱1.971.803.76±0.0299.661.257 2 药根碱0.540.420.96±0.00100.960.738 3 氧化小檗碱2.372.635.01±0.03100.351.137 2 盐酸小檗碱9.7711.3821.26±0.15100.971.264 5 吴茱萸碱4.473.728.19±0.02100.090.515 9 掌叶防己碱1.671.613.28±0.02100.031.544 9 吴茱萸次碱11.1312.1023.32±0.08100.760.686 2 C60去氢吴茱萸碱2.363.345.67±0.0898.371.673 5 二氢吴茱萸新碱1.110.952.05±0.0199.021.173 6 四氢小檗碱0.130.190.32±0.00101.571.446 5

表13 样品中主要成分含量

Table 13 Contents of main compounds in samples

组分化合物测得量/mg占该组分生物碱比/%占该组分洗脱总量比/%组分化合物测得量/mg占该组分生物碱比/%占该组分洗脱总量比/% C40盐酸小檗碱300.17±16.4332.9620.15C60去氢吴茱萸碱2.71±0.7786.866.87 黄连碱77.91±4.898.565.23 吴茱萸碱0.10±0.023.210.25 掌叶防己碱51.80±3.275.693.48 四氢小檗碱0.04±0.011.280.10 表小檗碱32.01±1.963.512.15C95吴茱萸次碱0.66±0.0236.934.14 非洲防己碱21.96±0.942.411.47 吴茱萸碱0.33±0.0118.442.07 格兰地新17.69±0.301.941.19 7β-羟基吴茱萸次碱0.15±0.018.320.93 药根碱16.61±0.861.821.11 二氢吴茱萸新碱0.10±0.015.750.64 去氢吴茱萸碱8.66±0.390.950.58 去氢吴茱萸碱0.10±0.015.470.61 C60柠檬苦素6.08±0.20−15.40 氧化小檗碱0.41±0.0522.682.54 吴茱萸苦素2.07±0.31−5.24

3 讨论

3.1 制备工艺建立

左金丸以生物碱类为主要活性成分，但是还含有一定数量的柠檬苦素类成分。根据文献报道，柠檬苦素类成分虽然具有多种药理活性，但同时还存在基因毒性，可致肝损伤[7]、细胞突变和染色体畸变[25-26]，而且与左金丸主要功效的相关性不大。在组分中药理论指导下，将柠檬苦素类与生物碱类分别富集，进行药效学和药理学研究，有助于高效低毒的现代中药研制。黄连中的生物碱多为异喹啉类生物碱，极性较大，而吴茱萸中的生物碱为吲哚类和喹诺酮类生物碱，极性较小。二者在色谱行为方面存在差异，在色谱洗脱过程中很难采用一种溶剂或一个梯度进行高效洗脱。已有研究报道，采用大孔树脂柱和单一洗脱梯度纯化，所得左金丸总生物碱的含量较低（38.47%）[10]。而且，这种洗脱方式也不能将吴茱萸中的柠檬苦素类分离出来。为此，本研究采用组分中药研究中的色谱极性分段筛选方法，通过调整溶剂极性并分段洗脱的方式达到分离的目的。

3.2 定性定量研究

工艺所得C40组分主要含有31种化合物，其中含量最高的成分为盐酸小檗碱。该组分总生物碱质量分数高达61.13%，绝大部分为黄连生物碱，是最主要的生物碱组分。C95组分主要含有36种化合物，其中含量最高的为吴茱萸次碱，大部分为吴茱萸中极性较小的生物碱，包括吲哚和喹诺酮生物碱2个类别。该组分总生物碱质量分数为11.19%，与C40组分相加超过60%。C60组分主要含有32种化合物，其中含量最高的为柠檬苦素，并且柠檬苦素和吴茱萸苦素二者相加占该组分的20.65%，为优势成分。因此C40和C95是具有潜在生物活性的生物碱类组分，C60组分则为柠檬苦素类组分。定性定量分析进一步证实了采用这种分离工艺可实现总生物碱和柠檬苦素类的高效分离，在明确各组分的药理活性和毒性的基础上，3个组分按照不同比例进行组分配伍研究，可以获得新型的组分中药新处方。

本研究建立了重现性好的左金丸配伍组分制备工艺，所得组分活性成分含量高，质量稳定，为进一步的成药性研究和组分中药研制奠定了基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Preparation process of components for component-based Chinese medicine of Zuojin Pills

LIU Si-qi, WANG Ru-feng

School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To establish the preparation process of components for component-based Chinese medicine of Zuojin Pills (左金丸) and analyze the main compounds of components qualitatively and quantitatively.Orthogonal experimental design was employed to determine the optimal extracting solvent, extracting time and extracting times. The resin type, optimum loading concentration, loading quantity, diameter-height ratio and adsorption time were investigated using total alkaloid content as index. The qualitative and quantitative analysis of main compounds were conducted by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) and UPLC, respectively.The selected process was that the powders were extracted with 10 folds of 70% ethanol under reflux two times for 1 h each. AB-8 macroporous resin was selected to purify the extracts. The optimum loading concentration was 0.5 g/mL, loading volume was 0.12 BV, diameter-height ratio was 1:12 and adsorption time was 1 h. The elution was carried out with 28 BV 40% ethanol, 16 BV 60% ethanol and 13 BV 95% ethanol successively to obtain three components, C40, C60 and C95 components. Thirty-one compounds, which were mainly alkaloids from(Huanglian), were identified from C40 component. Among them, the content of berberine was the highest (20.15%). Thirty-two compounds, which were mainly limonoids from(Wuzhuyu), were identified from C60 component. Among them, the content of limonin was the highest (15.40%). Thirty-six compounds, which were mainly alkaloids from, were identified from C95 component. Among them, the content of rutaecarpine was the highest (4.14%).The preparation process established herein is repeatable and the resultant components with high content of active compounds are qualitive stable. This study lays a foundation for further research and development of druggability and component-based Chinese medicine of Zuojin Pills.

Zuojin Pills;;; component-based Chinese medicine; UPLC-MS/MS; alkaloids; berberine hydrochloride; limonin; rutaecarpin

R283.6

A

0253 - 2670(2022)19 - 6001 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.007

2022-04-12

国家重点研发计划（2018YFC1704506）

刘斯琪，博士研究生，研究方向为中药药效物质。E-mail: liusiqi_wxjs@163.com

王如峰，教授，博士生导师，主要从事中药化学成分研究工作。Tel: (010)53912163 E-mail: wrf@bucm.edu.cn

[责任编辑 郑礼胜]