油橄榄果渣抗氧化部位化学成分的研究

陈根振， 王蝴蝶， 裴 栋， 黄新异， 邸多隆,3*

( 1. 甘肃中医药大学 药学院， 兰州 730000； 2. 中国科学院兰州化学物理研究所， 中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室， 兰州 730000； 3. 青岛市资源化学与新材料研究中心， 山东 青岛 266000 )

油橄榄()系木犀科木犀榄属油料植物，是人类最早认识、驯化和种植的油料作物之一。我国自1964年以来，开始陆续引种油橄榄品种100多个(张佳等，2013)，现主要在甘肃陇南、云南西北部、四川广元和达州等地种植(王着，2012)。橄榄油是“地中海膳食模式”中最重要的组成部分之一，是在常温下通过纯物理方法冷榨提取的果肉油，被誉为“飘香的软黄金”(Guo et al., 2018)。

油橄榄果渣是在橄榄油生产加工过程中产生的副产物，其中含有黄酮类(张华玲等，2016)、萜类(Claro-Cala et al., 2020)和酚类(Css et al., 2019；Speroni et al., 2020)等多种化学成分。据报道，每吨油橄榄鲜果经榨油后会产生350～400 kg果渣(苏瑶等，2021)。油橄榄果渣作为一种生物废弃物，一般的处理方式是被当作肥料和燃料处理，或者被当作废弃物直接丢弃，这些处理方式不但造成了环境的污染而且忽略了该资源的潜在价值，不符合循环经济的理念(张华玲等，2016)。如何提高油橄榄果渣的利用率是油橄榄产业亟须解决的关键性问题。为此，本文以油橄榄果渣为研究对象，通过DPPH·法评价了油橄榄果渣不同提取部位的抗氧化能力，并利用多种柱色谱技术对其主要的抗氧化部位的化学成分进行了系统的研究，分离得到17个化合物，其中，化合物没食子酸()、香草酸()、咖啡酸()、丁香酸()和芦丁()为首次从油橄榄果渣中分离得到，为油橄榄果渣抗氧化活性产品的开发供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和材料

Agilent 1260制备高效液相色谱仪(G1311A 二元泵，G1315D DAD 检测器，ChemStation 色谱工作站，美国 Agilent 公司)；中压制备液相色谱系统(NP7010C 二元泵， NU3000C 检测器，Easy Chrom-1000色谱工作站，江苏汉邦科技有限公司)； LC-MS 8050三重四极杆质谱仪(日本岛津公司)；ULTRA SHIELD 400 plus 核磁共振波谱仪(德国布鲁克公司)；高速多功能粉碎机(SS-1022型，武义海钠电器有限公司)； UV756紫外-可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限责任公司)。

Sephadex LH-20填料(美国GE Healthcare公司)；ODS 色谱柱(SinoChrom ODS-BP，4.6 mm × 250 mm，5 μm)；柱色谱用硅胶(200～300目，青岛海洋化工厂)；薄层色谱用硅胶板(GF，青岛海洋化工厂)；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)(上海麦克林生化科技有限公司)；维生素C(天津市登峰化学试剂厂)；制备液相所用试剂均为色谱纯；提取分离所用试剂均为分析纯；实验用水为蒸馏水。

实验用油橄榄果渣经西北师范大学孙坤教授鉴定为木犀科木犀榄属油橄榄 ()的果实经冷榨提取果肉油后得到的废弃物，来自陇南田园油橄榄科技开发有限公司。

1.2 提取和分离

称取干燥的油橄榄果渣3.85 kg，粉碎，75%乙醇(料液比1∶10)回流提取3次，每次1 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，得橄榄果渣混悬液。加入适量去离子水后，依次用3倍体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位(164.76 g，标记为部位A)、乙酸乙酯部位(77.61 g，标记为部位B)、正丁醇部位(50.00 g，标记为部位C)和水部位(121.20 g，标记为部位D)，各部位萃取物分别占干燥油橄榄果渣总重量的4.28%、2.02%、1.30%和3.15%。

1.3 抗氧化活性部位筛选

参考李春爱等(2022)的方法略作调整，通过DPPH·的清除能力来确定油橄榄果渣不同提取部位的抗氧化活性。步骤如下。(1)0.2 mmol·LDPPH·乙醇溶液的配制：精密称取 0.039 5 g DPPH·，加入95%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，即得1 mmol·LDPPH·乙醇母液，用时取10 mL定容至50 mL，即得0.2 mmol·LDPPH·乙醇溶液。(2)样品溶液的配制：精密称取油橄榄果渣不同提取部位浸膏0.010 0 g，加入甲醇定容至10 mL，得到1 mg·mL的样品溶液，并用甲醇稀释得到5个质量浓度梯度的样品溶液，其质量浓度分别为50、100、150、200、250 μg·mL。(3)DPPH·清除能力的测定：将2 mL样品溶液添加到2 mL含0.2 mmol·LDPPH·乙醇溶液中，混合均匀，室温放置30 min，在517 nm处测定吸光度。

DPPH·清除率 = [1-(-)/] × 100%。

式中：为样品的吸光度；为参比的吸光度；为空白的吸光度。

表 1 DPPH·清除率的实验方法Table 1 Experimental methods of DPPH· scavenging rate

1.4 化学成分分离

取乙酸乙酯部位萃取物(77.61 g)，用少量甲醇溶解，与硅胶拌样(1∶3)，采用硅胶柱色谱分离。以二氯甲烷-甲醇(比例分别为50∶1、25∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、1∶1)溶剂系统梯度洗脱，使用薄层色谱合并相同的组分，共得到7个部位，编号为Fr.1～Fr.7。其中Fr.2(3.1 g)中析出了大量的白色粉末，重结晶后得到化合物(0.5 g)，Fr.2的剩余部分(2.3 g)采用硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇(10∶1)溶剂系统洗脱，分别得到化合物(75.1 mg)、(8.4 mg)、(15.3 mg)、(22.7 mg)。Fr.3(1.8 g)经制备液相色谱(流动相为甲醇和水，0～10 min，甲醇17%；10～20 min，甲醇17%～20%；20～25 min，甲醇20%～30%；25～45 min，甲醇30%～40%；45～60 min，甲醇40%)梯度洗脱，分离得到化合物(8.7 mg)、(10.3 mg)、(9.8 mg)、(23.5 mg)、(7.5 mg)。Fr.4(0.9 g)经制备液相色谱(流动相为甲醇和水，0～10 min，甲醇20%；10～20 min，甲醇20%～30%；20～30 min，甲醇30%)梯度洗脱，并采用Sephadex LH-20柱色谱(流动相为甲醇和水，比例为30∶70)分别纯化后得到化合物(9.8 mg)、(10.4 mg)、(7.2 mg)、(9.1 mg)、(10.6 mg)、(6.8 mg)、(8.3 mg)。

2 结果与分析

2.1 活性部位筛选结果

以维生素C(Vc)为阳性对照，测定油橄榄果渣不同提取部位的DPPH·清除率。结果如图1所示，建立的Vc标准曲线为=1.243 3+0.491 2(=0.995 1)，经计算得Vc的半数抑制浓度(IC)为12.96 μg·mL。如图2所示，在测定的样品质量浓度范围内，随着样品质量浓度不断增加，不同提取部位的DPPH·清除率均不断增加，且呈现出一定的量效关系。结果表明，在所测定的质量浓度范围内，油橄榄果渣不同提取部位对DPPH·均有一定的清除能力，油橄榄果渣的石油醚部位(A)、乙酸乙酯部位(B)、正丁醇部位(C)和水部位(D)对DPPH·的IC值分别为3 751.45、119.11、415.00、873.07 μg·mL，即各组DPPH·清除率的大小顺序为乙酸乙酯部位(B)>正丁醇部位(C)>水部位(D)>石油醚部位(A)，故乙酸乙酯部位的抗氧化活性较好。

图 1 维生素C的DPPH·清除率标准曲线Fig. 1 Standard curve of DPPH· scavenging rate of vitamin C

Vc. 维生素C; A. 石油醚部位; B. 乙酸乙酯部位; C. 正丁醇部位; D. 水部位。Vc. Vitamin C; A. Petroleum ether extract; B. Ethyl acetate extract; C. n-Butanol extract; D. Water extract. 图 2 油橄榄果渣不同提取部位的DPPH·清除率Fig. 2 DPPH· scavenging rates of different extracts of Olea europaea pomace

2.2 化学成分结构鉴定

3 讨论与结论

油橄榄果渣是橄榄油加工过程中产生的废弃物，其化学成分以黄酮类、三萜类和苯丙素类化合物居多，具有抗氧化、抗炎、抗菌和降血糖等药理作用。本文测定了油橄榄果渣中不同提取部位清除DPPH·的能力，结果表明乙酸乙酯部位具有显著的抗氧化活性，其DPPH·清除能力的IC值为119.11 μg·mL。在此基础上，利用多种柱色谱技术从油橄榄果渣的乙酸乙酯部位中分离得到17个化合物，并运用核磁共振波谱等方法鉴定了化合物的结构。17个化合物中，黄酮类化合物有5个、萜类化合物有3个、苯丙素类化合物有3个，其含量分别占乙酸乙酯部位的0.09%、0.79%和0.03%。其中，没食子酸()、香草酸()、咖啡酸()、丁香酸()和芦丁()为首次从油橄榄果渣中分离得到的化合物。没食子酸()、咖啡酸()和丁香酸()均具有明显的抗氧化、抗炎和抗肿瘤等药理活性(杨九凌等，2013；郑雪花等，2017； Kahkeshani et al., 2019；dos Santos et al., 2020)。香草酸()不仅具有抗氧化和抗炎的作用，还能抑制血小板聚集(孔令雷等，2020)，尤其对二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid, AA)和凝血酶(thrombin, THR)诱导引起的血小板聚集具有显著抑制作用。芦丁()为一种重要的黄酮类化合物，能够显著减弱1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP)诱导的细胞活力丧失，减轻活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的产生，并抑制抗氧化酶活性的破坏，此外，芦丁也降低了用 MPP处理的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中 γH2AX 和COX-2的蛋白质表达水平(Enogieru et al., 2021)。

化合物的抗氧化活性与其结构中羟基的数量有关(原姣姣，2016)，如羟基酪醇()的抗氧化活性高于酪醇()。当化合物有多个酚羟基时，其相对位置决定了抗氧化活性的强弱，即邻位 >对位>间位。苯环上4位键合碳碳双键或其他供电子基团，可能通过π-π或p-π共轭体系使化合物结构更加稳定从而提高抗氧化活性(Xie et al., 2015)，如咖啡酸()的抗氧化活性高于原儿茶酸()和香草醛()。而黄酮类化合物B环上3′位和4′位的邻二酚羟基能显著提高其抗氧化活性(Zuo et al., 2018)，本文中化合物、、、的结构符合这个特征。橄榄苦苷()仅存在于木犀科植物中，由三个结构亚基羟基酪醇、亚麻酸和葡萄糖分子组成，因其具有羟基酪醇的结构，有较强的抗氧化活性。综上，可初步推测油橄榄果渣的抗氧化活性与其中的黄酮类和裂环烯醚萜类化合物有关(Liu et al., 2014)。此外，据文献报道(Joaquín et al., 2018；Jiménez-Herrera et al., 2019；袁静等，2021；Tian et al., 2021)，乙酸乙酯部位分离得到的17个化合物均表现出不同程度的抗氧化能力，证实了油橄榄果渣具有良好的抗氧化活性。

生物机体内每天不断产生自由基，过量的自由基造成的氧化损伤对机体形成不可避免的伤害，因此，寻找天然的抗氧化剂就显得至关重要。油橄榄果渣作为一种生物废弃物，具有良好的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂的原料，如何高效、宏量富集所分离得到的这些化合物，以及如何将其开发成商品化的天然抗氧化剂，有待于进一步系统和深入的研究。此外，本文为今后油橄榄果渣的高值化利用及天然抗氧化剂的开发提供了一定的参考依据。