云南三种特色柑橘属果皮精油成分及活性研究

李 渔， 陈 波， 施建莲， 马海玲， 习杨彦彬， 刘 佳*

( 1. 昆明医科大学 海源学院， 昆明 650101； 2. 云南省药品评价中心， 昆明 650101； 3. 昆明医科大学 科技成果孵化中心， 昆明 650500； 4. 云南新兴职业学院， 昆明 650501； 5. 昆明医科大学 神经科学研究所， 昆明 650500 )

芸香科柑橘属(L.)植物常称柑橘。中国是柑橘发源中心之一，种植历史久远，栽培面积居世界前列(方德秋, 1993)。柑橘属植物是柑橘类果实的重要来源，包括具有重要经济价值的物种橙()、柚()、柑()、柠檬 ()等(方德秋, 1993)。虽然柑橘的果皮具有重要药用价值，但仅一部分得到利用(叶荫民,2010)。同时，果皮精油(张薇等,2005)也是柑橘属植物重要的特征性指标(黄远征等, 1998)，其开发利用能提高其附加值(丁晓波等，2012；樊二齐等，2012)，从而推动云南贫困地区的脱贫致富。

云南西双版纳曼赛龙柚 (cv. Mansailong)，是中国科学院西双版纳热带植物园研究人员60年前从西双版纳勐腊县勐捧镇曼赛龙村的实生柚培育出的优良品种，其果实扁球形或近球形,果肉红色艳丽、细嫩化渣、酸甜适宜, 含丰富的维生素C等营养物质。云南元江绿皮冰糖橙(Osbeck)是中国唯一的绿皮冰糖橙(曾柏全等，2003)，成熟果实中含有丰富的氨基酸，如谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸等17种人体必需的氨基酸。云南德宏青柠()，又称来檬，其成熟果实为黄绿色，有球形、椭球形或倒卵形，可作为天然香料、食品添加剂和保健品、药品、化妆品等的原料。国内外学者对柑橘属植物包括柑橘、柚、橙、柠檬等果肉进行了研究，从中发现黄酮类、香豆素、柠檬苦素、胡萝卜素类等天然小分子化合物，部分化合物具有显著抗肿瘤活性(丁晓波等，2012)。然而，西双版纳曼赛龙柚、元江绿皮冰糖橙、德宏青柠的果皮精油成分的相关研究仍鲜有报道，尤其是西双版纳曼赛龙柚，并且三者的精油成分相关活性研究目前尚未见有报道(王毓炜等，2008)。

本研究选取云南近年来高产热销的西双版纳曼赛龙柚、元江绿皮冰糖橙、德宏青柠作为材料，对其果皮中提取的精油进行研究，分析其精油的产油率、化学成分差异，探讨其香气成分及抗肿瘤活性，为云南三种特色柑橘属植物的应用及开发提供一定的理论基础和具科学价值的参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

云南西双版纳曼赛龙柚，2016年11月购自中国科学院西双版纳热带植物园曼赛龙柚种植示范基地；云南元江绿皮冰糖橙，2016年11月购自元江县哀牢山绿皮冰糖橙种植示范基地；云南德宏青柠，2017年7月购自云南德宏州青柠种植示范基地。

气相色谱-质谱联用仪：购自美国Perkin Elmer公司，型号为CLARUS 600 GC-MS。酶联免疫检测仪(酶标仪)：购自美谷分子仪器有限公司，型号为SpectraMax M5。移液枪：购自艾本德(eppendorf)公司。

1.2 方法

1.2.1 精油提取 将所购曼赛龙柚、绿皮冰糖橙和青柠各取果皮1 000 g，用水洗净、晾干，分2次置于圆底烧瓶中，加超纯水1 000 mL，连接挥发油测定器和球形冷凝管，保持水沸腾稳定产生蒸汽，连续提取9 h。加热停止后，收集精油，以10 mL乙醚冲洗精油，并将提取液转移到分液漏斗中，充分摇匀后静置分层，收集乙醚层，加入无水NaSO干燥，低温回收乙醚得到淡黄色透明液态精油，用以气相色谱-质谱分析。

1.2.2 GC-MS联用仪分析 气相色谱工作条件：毛细管柱DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度为250 ℃；载气为高纯氦(纯度≥99.999%)，流速为1.0 mL·min；进样方式为分流进样，进样量为1 μL，分流比为30∶1。程序升温条件：首先，初始温度50 ℃，保持5 min；然后，2 ℃·min升至80 ℃，3 ℃·min升至230 ℃，保持16 min；最后，12 ℃·min升至250 ℃，保持20 min。

质谱工作条件：电离方式为EI；离子化电压为70 eV；扫描范围为35～450 amu；离子源温度为230 ℃；传输线温度为260 ℃；在WILEY、NIST08谱库进行谱图检索。

1.2.3 抗瘤活性测定

1.2.3.1 细胞培养与培养基 人乳腺癌细胞(MCF-7)、结直肠癌细胞(HCT-116)、胃癌细胞(MKN-45)3株细胞购自中国科学院上海细胞库。1640培养基、McCoy5A 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)均购自GIBCO有限公司，噻唑蓝(MTT)购自炎熙生物，二甲基亚砜(DMSO)购自索莱宝公司。

1.2.3.2 用MTT法检测三种精油抗肿瘤活性 取对数生长期细胞用胰蛋白酶消化后，用细胞完全培养液每1 mL稀释至1×10个，接种于 96孔细胞培养板上，每孔90 μL。在37 ℃、5% CO培养箱中培养 24 h，待细胞贴壁后，实验组按倍半稀释法设置 5 个不同浓度精油(15、30、60、120、200 μg·mL)，每孔加入10 μL的精油，同时设置阴性对照组和正常对照组，每组 5 个复孔。培养箱中继续培养48 h，每孔加入MTT(5 mg·mL)溶液 10 μL，继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 100 mL DMSO使结晶充分溶解，用酶标仪测定在570、630 nm双波长下各孔的吸光度()值，计算各药物浓度对肿瘤细胞生长抑制率。肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验组值阴性对照组值)×100。用graphpad prism 5软件计算半数抑制浓度(IC)。半数抑制浓度(IC) 是衡量药物抑制肿瘤增殖能力的标准之一(刘梦瑶等，2019)。

2 结果与分析

2.1 三种云南特色柑橘属果皮精油产率对比

德宏青柠的果皮精油出油率最高，为0.72%；元江绿皮冰糖橙的次之，为0.59%；西双版纳曼赛龙柚的最低，为0.51%。

2.2 三种云南特色柑橘属果皮精油组分分析

根据气相色谱-质谱联用分析仪，获得三种精油样品的总离子流色谱(图1，图2，图3)，将其与计算机质谱库匹配，进行人工解析后确定精油样品化学组分的名称，并采用峰面积归一法计算出各组分含量(赵文红等，2007)(表1，表2，表3)。

图1 西双版纳曼赛龙柚精油样品的总离子流色谱图Fig. 1 Total ion flow chromatogram of Citrus maxima cv. Mansailong peel essential oil samples

图 2 元江绿皮冰糖橙精油样品的总离子流色谱图Fig. 2 Total ion chromatogram of Citrus sinensis Osbeck peel essential oil samples

图 3 德宏青柠果皮精油样品的总离子流色谱图Fig. 3 Total ion chromatogram of Citrus aurantiifolia peel essential oil samples

表 1 西双版纳曼赛龙柚精油样品组分分析Table 1 Component analysis of essential oil samples from Citrus maxima cv. Mansailong peel

表 2 元江绿皮冰糖橙精油样品组分分析Table 2 Component analysis of essential oil samples from Citrus sinensis Osbeck peel

表 3 德宏青柠果皮精油样品组分分析Table 3 Component analysis of essential oil samples from Citrus aurantiifolia peel

本研究发现西双版纳曼赛龙柚、元江绿皮冰糖橙、德宏青柠的精油成分比较复杂，并且其所含的多种成分具有重要的药用价值和化学工业价值，如三种植物的果皮共有成分月桂烯、萜品烯。通常情况下，大多数植物中月桂烯的含量很少(郝静梅等,2017)，满足不了香料工业的需求，国际上主要依靠-蒎烯的裂解(甘芝霖等，2019)，而-蒎烯在西双版纳曼赛龙柚和元江绿皮冰糖橙果皮精油中含量分别为0.255%和0.558%。近年来，月桂烯被广泛用于合成香茅醛、l-薄荷醇、新铃兰醛和龙涎酮等名贵香料产品和有机合成中间体(杨阳等,2012；何金洞,2012)。据最新研究报道，萜品烯具有成为天然抗氧化剂的潜力，有望基于此开发各类抗氧化药物和保健品。此外， 西双版纳曼皮精油中有13种，其中化合物种类含量高低排序为烯烃>醛>(环)烷烃>醇。

2.3 西双版纳曼赛龙柚果皮精油抑瘤活性测定

不同浓度的西双版纳曼赛龙柚果皮精油对胃癌细胞(MKN-45)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和结直肠癌细胞(HCT-116)的增殖有不同程度的抑制作用，并呈剂量依赖关系(图4)，半数抑制浓度(IC)分别为44.14、54. 69、39. 10 μg·mL。

图 4 西双版纳曼赛龙柚果皮精油对肿瘤细胞抑制的量效关系Fig. 4 Dose-effect relationship of Citrus maxima cv. Mansailong peel essential oil on tumor cell inhibition

2.4 元江绿皮冰糖橙皮精油抑瘤活性测定

不同浓度的元江绿皮冰糖橙皮精油对胃癌细胞(MKN-45)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和结直肠癌细胞(HCT-116)的增殖有不同程度的抑制作用，并呈剂量依赖关系(图5)，半数抑制浓度(IC)分别为72.76、67. 70、68. 25 μg·mL。

图 5 元江绿皮冰糖橙皮精油对肿瘤细胞抑制的量效关系Fig. 5 Dose-effect relationship of Citrus sinensis Osbeck peel essential oil on tumor cell inhibition

2.5 德宏青柠果皮精油抑瘤活性测定

不同浓度的德宏青柠果皮精油对胃癌细胞(MKN-45)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和结直肠癌细胞(HCT-116)的增殖有不同程度的抑制作用，并呈剂量依赖关系(图6)，半数抑制浓度(IC)分别为87.90、69.39、65. 74 μg·mL。

图 6 德宏青柠果皮精油对肿瘤细胞抑制的量效关系Fig. 6 Dose-effect relationship of Citrus aurantiifolia peel essential oil on tumor cell inhibition

3 讨论与结论

从通过GC-MS开展定性定量成分分析可以看出，西双版纳曼赛龙柚果皮精油中含有24种含量在0.01%以上的化学成分，其中化合物种类含量高低排序为酯>烯烃>醛>(环)烷烃>醇>酚、萘；元江绿皮冰糖橙皮精油中有11种，其中化合物种类含量高低排序为烯烃>(环)烷烃>醇； 德宏青柠果赛龙柚和元江绿皮冰糖橙果皮精油中都含有3，7-二甲基-1,6辛二烯-3-醇和活性物质柠檬烯，并且柠檬烯在西双版纳曼赛龙柚果皮精油中含量高达72.097%。柠檬烯在美国食用香料与提取物制造商协会认为其毒性属于GRAS级(连建伟等,2001)，还有在体外对诸如李斯特菌、青霉菌、绿霉菌和黄曲霉菌等真菌(李泰然,2003)、荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌两种食源性致病菌均存在抑菌效果(郭苗苗等,2013)。

此外，本研究为国内首次对西双版纳曼赛龙柚、元江绿皮冰糖橙、德宏青柠果皮挥发油进行体外抗肿瘤活性研究，并发现对胃癌细胞(MKN-45)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和结直肠癌细胞(HCT-116)具有一定的抗肿瘤细胞增殖活性(杨丽华等,2020)。本研究结果可以为西双版纳曼赛龙柚、元江绿皮冰糖橙、德宏青柠果皮在食品、保健食品、化妆品和医药产业方面的应用提供理论基础，有助于柑橘属果皮的利用，以及变废为宝提高其附加值(赵文红等,2009)。