拔毒散的化学成分及其抗炎活性研究

罗明楚, 石小翠, 孙 朋, 鲁建美, 宋兴震, 贾慧珍, 吴 敏, 许又凯

( 1. 热带植物资源可持续利用重点实验室 中国科学院西双版纳热带植物园， 云南 勐腊 666303； 2. 中国科学院大学， 北京 100049 )

拔毒散()为锦葵科黄花稔属植物，主要分布在四川、贵州、云南和广西等地(中国科学院中国植物志编辑委员会，1982)。在中国云南傣族地区，拔毒散作为一种传统药用植物，具有悠久的使用历史，其茎叶常用于治疗诸疮肿毒、皮肤瘙痒、跌打损伤、刀枪伤等疾病(李维峰等，2006；段立纲等，2013)。然而，围绕这些药效的相关研究却鲜有报道。化学成分研究方面，国内学者通过分离鉴定，发现该植物主要的化合物类型为甾体类的蜕皮激素(姚春所，2000；曲世津，2006；雷春，2008)。为了深入研究该植物化学资源，寻找与传统药用价值相关的抗炎活性成分，本研究利用经典的色谱学分离手段和核磁共振波谱技术对拔毒散的化学成分进行了分离和鉴定，共得到16个单体化合物，并利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW 264.7炎症模型评价化合物的抗炎活性，以期明确该植物抗炎活性的物质基础，并为其进一步开发利用提供新的思路及理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器和试剂

1.1.1 材料 拔毒散的地上部分于2020年5月13日采集自云南省西双版纳傣族自治州勐腊县勐仑镇，由中国科学院西双版纳热带植物园高级实验员肖春芬老师鉴定，植物标本保存于中国科学院西双版纳热带植物园标本馆(No.153662)；RAW 264.7细胞购于中国科学院昆明动物所细胞库。

1.1.2 仪器和试剂 ESI-MS(UPLC-IT-TOF，日本岛津制作所)；500 MHz 核磁共振波谱仪(Avance III 500，德国Brucker公司)；600 MHz 核磁共振波谱仪(Avance III 600，德国Brucker公司)；半制备型HPLC配备 Waters 600 泵(Waters 2996二极管阵列紫外检测器)，色谱柱为YMC-Pack ODS-A (250 mm × 10 mm，S-5 μm，3 mL·min)；柱层析硅胶(200～300 目，青岛海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20 (40～70 μm，瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司)；微孔树脂MCI (CHP20/P120，75～150 μm，日本三菱公司)。

生物安全柜(BSC-1100II B2-X，济南鑫贝西生物技术有限公司)；二氧化碳细胞培养箱(QP-80，济南鑫贝西生物技术有限公司)；倒置生物显微镜(NIB-100，宁波永新光学股份有限公司)；多功能酶标仪(MULTISKAN MK3，美国Thermo公司)。

T25培养瓶、离心管、96孔板(美国Corning公司)；胎牛血清FBS(美国Gibco公司)；DMEM培养基、PBS、胰蛋白酶(以色列Biological Industries公司)；脂多糖、地塞米松(美国Sigma公司)；Griess试剂、MTS(美国Promega公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 提取与分离 将采集的拔毒散阴干并粉碎后，得到样品3.1 kg，用95%的乙醇常温浸提7 d，合并提取液并减压浓缩，重复3次，共得到浸膏182 g。加水分散浸膏成混悬液，用乙酸乙酯萃取得到粗样60 g，再将其置于微孔树脂MCI色谱柱中，用不同梯度的甲醇∶水体系(30∶70，50∶50，70∶30，90∶10)依次洗脱，TLC点板合并极性相同的部分，得到Fr. 1～Fr. 4四个组分。取Fr. 2(8 g)置于硅胶色谱柱中，用不同梯度乙酸乙酯和丙酮以及二氯甲烷和甲醇反复洗脱，再经过Sephadex LH-20 (甲醇)洗脱、半制备HPLC(乙腈∶水)梯度洗脱，得到得到化合物(8.5 mg)、(3.0 mg)、(11.2 mg)、(10.8 mg)、(6.1 mg)、(4.4 mg)、(6.5 mg)、(2.4 mg)、(2.6 mg。取Fr.3(2 g)和Fr. 4(8 g)分别置于硅胶色谱柱中用不同梯度二氯甲烷和甲醇反复洗脱，结合Sephadex LH-20 (甲醇)以及半制备HPLC，分别得到化合物(3.4 mg)、(2.8 mg)、(4.1 mg)、(3.2 mg)、(4.8 mg)和化合物(3.5 mg)、(11.0 mg)，化合物结构图见图1。

1.2.2 抗炎活性实验 RAW 264.7细胞使用DMEM完全培养基(10%FBS，1%青霉素、链霉素)，在37 ℃、5% CO的细胞培养箱中培养。选择处于对数生长期的细胞，按密度为每毫升1×10个均匀种入96孔板，每孔100 μL。贴壁培养18 h后，空白组加入完全培养基，模型组加入含终浓度为1 μg·mL脂多糖(LPS)的完全培养基，实验组在模型组的基础上加入终浓度为50 μmol·L的待测化合物，阳性对照为地塞米松(dexamethasone，Dex)。处理24 h后，按照Griess试剂的标准操作处理。同一批次的细胞按照MTS法测定细胞活力。

所有实验均设置3个复孔，结果以平均值加减标准差表示。利用 SPSS 25.0 软件进行单因素方差分析和 Dunnett’s 多重比较检验来分析实验的数据，<0.05接受为显著性差异。采用回归分析的方法计算IC值。

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定

化合物黄色针状晶体，分子式为CHO。ESI-MS：449 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 8.10 (2H, d,=8.9 Hz, H-2′, 6′), 6.89 (2H, d,=8.9 Hz, H-3′, 5′), 6.42 (1H, d,=2.1 Hz, H-8), 6.22 (1H, d,=2.1 Hz, H-6), 5.15 (1H, d,=7.8 Hz, H-1″), 3.83-3.42 (6H, overlap, H-2″-6″)。C NMR (125 MHz, CDOD): 179.69 (C-4), 166.03 (C-7), 163.08 (C-5), 161.60 (C-4′), 159.06 (C-9), 158.51 (C-2), 135.57 (C-3), 132.36 (C-2′, 6′), 122.69 (C-1′), 116.10 (C-3′, 5′), 105.67 (C-10), 104.94 (C-1″), 99.87 (C-6), 94.73 (C-8), 77.13 (C-5″), 75.02 (C-3″), 73.01 (C-2″), 70.01 (C-4″), 61.98 (C-6″)。以上数据与文献(李昉等，2010)基本一致，故鉴定为kaempferol-3---D-glucopyranoside。

化合物黄色无定型粉末，分子式为CHO。ESI-MS：595 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 8.08 (2H, d,=8.9 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d,=8.8 Hz, H-3′, 5′), 6.42 (1H, d,=2.0 Hz, H-8), 6.22 (1H, d,=2.0 Hz, H-6), 5.14 (1H, d,=7.2 Hz, H-1″), 4.52 (1H, d,=1.6 Hz, H-1‴), 1.13 (3H, d,=6.2 Hz, H-6‴)。C NMR (125 MHz, CDOD): 179.41 (C-4), 166.24 (C-7), 163.07 (C-5), 161.53 (C-4′), 159.39 (C-2), 158.62 (C-9), 135.51 (C-3), 132.38 (C-2′, 6′), 122.77 (C-1′), 116.14 (C-3′, 5′), 104.63 (C-10), 104.58 (glc C-1″), 102.44 (rha C-1‴), 100.05 (C-6), 94.91 (C-8), 78.15 (glc C-3″), 77.23 (glc C-5″), 75.77 (glc C-2″), 73.89 (rha C-4‴), 72.29 (glc C-4″), 72.10 (rha C-3‴), 71.45 (rha C-2‴), 69.74 (rha C-5‴), 68.56 (glc C-6″), 17.92 (rha C-6‴)。上述数据与文献(冯卫生等，2007)基本一致，故鉴定为kaempferol-3--rutinoside。

化合物黄色粉末，分子式为CHO。ESI-MS：303 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 7.74 (1H, d,=2.1 Hz, H-2′), 7.64 (1H, dd,=8.4, 2.1 Hz, H-6′), 6.89 (1H, d,=8.5 Hz, H-5′), 6.40 (1H, d,=2.0 Hz, H-8), 6.19 (1H, d,=2.0 Hz, H-6)。C NMR (125 MHz, CDOD): 177.34 (C-4), 165.66 (C-7), 162.53 (C-9), 158.26 (C-5), 148.77 (C-2), 146.24 (C-3′), 137.24 (C-3), 124.15 (C-1′), 121.66 (C-6′), 116.22 (C-5′), 115.98 (C-2′), 104.50 (C-10), 99.25 (C-6), 94.41 (C-8)。上述数据与文献(周威等，2013)基本一致，故鉴定为槲皮素(quercetin)。

化合物白色针晶，分子式为CHO。ESI-MS：481 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 5.77 (1H, d,=2.5 Hz, H-7), 3.91 (1H, d,=3.0 Hz, H-3), 3.80 (1H, ddd,=12.1, 4.5, 3.1 Hz, H-2), 3.27 (1H, dq,=10.6, 1.4 Hz, H-22), 3.11 (1H, ddd,=10.4, 7.4, 2.5 Hz, H-9), 1.17 (3H, s, 27-OCH), 1.16 (3H, s, 26-OCH), 1.15 (3H, s, 21-OCH), 0.93 (3H, s, 19-OCH), 0.85 (3H, s, 18-OCH)。C NMR (125 MHz, CDOD): 206.44 (C-6), 167.97 (C-8), 122.13 (C-7), 85.21 (C-14), 78.40 (C-22), 77.89 (C-20), 71.29 (C-25), 68.69 (C-2), 68.50 (C-3), 51.77 (C-5), 50.51 (C-17), 49.85 (C-13), 42.38 (C-24), 39.26 (C-10), 37.35 (C-1), 35.06 (C-9), 32.84 (C-4), 32.50 (C-15), 31.77 (C-12), 29.71 (C-27), 28.95 (C-26), 27.32 (C-16), 24.41 (C-19), 21.51 (C-11), 21.49 (C-23), 21.05 (C-21), 18.05 (C-18)。上述数据与文献(Darwish & Reinecke, 2003)基本一致，故鉴定为20-hydroxyecdysone。

化合物白色针晶，分子式为CHO。ESI-MS：465 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 5.82 (1H, d,=2.6 Hz, H-7), 3.96 (1H, d,=3.0 Hz, H-3), 3.92～3.80 (1H, m, H-2), 3.60 (1H, ddd,=10.2, 3.2, 1.7 Hz, H-22), 3.16 (1H, ddd,=10.2, 7.0, 2.6 Hz, H-9), 2.39 (1H, dd,=12.9, 4.5 Hz, H-5), 1.21 (3H, s, 27-CH), 1.20 (3H, s, 26-CH), 0.98 (3H, s, 19-CH), 0.96 (3H, d,=6.8 Hz, 21-CH), 0.74 (3H, s, 18-CH)。C NMR (125 MHz, CDOD): 206.53 (C-6), 167.62 (C-8), 122.01 (C-7), 85.08 (C-14), 75.25 (C-22), 71.41 (C-25), 68.70 (C-2), 68.51 (C-3), 51.78 (C-5), 48.80 (C-17), 48.13 (C-13), 43.45 (C-20), 42.25 (C-24), 39.24 (C-10), 37.36 (C-1), 35.25 (C-9), 32.88 (C-4), 32.08 (C-12), 32.04 (C-15), 29.61 (C-27), 29.10 (C-26), 27.01 (C-16), 25.33 (C-23), 24.48 (C-19), 21.58 (C-11), 16.20 (C-18), 13.34 (C-21)。上述数据与文献(Budesinsky et al., 2008)基本一致，故鉴定为-ecdysone。

化合物白色针晶，分子式CHO。ESI-MS：465 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 5.82 (1H, d,=2.6 Hz, H-7), 3.96 (1H, d,=3.0 Hz, H-3), 3.84 (1H, ddd,=12.2, 4.5, 3.1 Hz, H-2), 3.16 (1H, ddd,=11.3, 7.1, 2.3 Hz, H-9), 1.28 (3H, s, 21-CH), 1.20 (6H, s, 26, 27-CH), 0.97 (3H, s, 19-CH), 0.86 (3H, s, 18-CH)。C NMR (125 MHz, CDOD): 206.46 (C-6), 168.10 (C-8), 122.08 (C-7), 85.52 (C-14), 75.98 (C-20), 71.47 (C-25), 68.70 (C-2), 68.51 (C-3), 53.34 (C-5), 51.80 (C-17),48.06 (C-13), 45.89 (C-24), 45.49 (C-22), 39.26 (C-10), 37.36 (C-1), 35.05 (C-9), 32.87 (C-4), 32.38 (C-15), 31.58 (C-12), 29.34 (C-27), 29.10 (C-26), 26.47 (C-19), 24.40 (C-21), 21.97 (C-11), 21.51 (C-16), 20.11 (C-23), 18.13 (C-18)。上述数据与文献(程永现等，2001)基本一致，故鉴定为22-deoxyecdysterone。

化合物白色针晶，分子式CHO。ESI-MS：497 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 5.82 (1H, d,=2.6 Hz, H-7), 3.95 (1H, d,=2.9 Hz, H-22), 3.84 (1H, ddd,=12.1, 4.4, 3.0 Hz, H-3), 3.66 (1H, dd,=10.4, 2.0 Hz, H-2), 3.53 (1H, dd,=9.6, 2.1 Hz, H-24), 3.16 (1H, ddd,=10.7, 5.2, 2.0 Hz, H-9), 1.23 (3H, s, H-21), 1.20 (3H, s, H-27), 1.16 (3H, s, H-26), 0.97 (3H, s, H-18), 0.90 (3H, s, H-19)。C NMR (125 MHz, CDOD): 206.44 (C-6), 167.92 (C-8), 122.17 (C-7), 85.22 (C-14), 80.37 (C-24), 78.48 (C-22), 77.82 (C-20), 73.40 (C-25), 68.71 (C-2), 68.52 (C-3), 51.80 (C-5), 50.49 (C-17), 48.61 (C-13), 39.27 (C-10), 37.36 (C-1), 35.10 (C-9), 32.98 (C-23), 32.87 (C-4), 32.48 (C-15), 31.79 (C-12), 26.26 (C-26), 24.50 (C-27), 24.41 (C-19), 21.57 (C-16), 21.52 (C-21), 21.00 (C-11), 18.08 (C-18)。上述数据与文献(程春梅等，2010)基本一致，故鉴定为abutasterone。

化合物无色针状结晶，CHO。ESI-MS：481 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 5.82 (1H, d,=2.5 Hz, H-7), 3.96 (1H, br s, H-3), 3.85 (1H, dt,=11.5, 3.5 Hz, H-2), 3.64～3.60 (1H, m, H-24), 3.60～3.57 (1H, m, H-22), 3.16 (1H, m, H-9), 1.22 (3H, s, H-21), 0.98 (3H, s, H-19), 0.96 (3H, d,=6.9 Hz, H-27), 0.92 (3H, d,=6.9 Hz, H-26), 0.90 (3H, s, H-18)。C NMR (125 MHz, CDOD): 206.43 (C-6), 167.90 (C-8), 122.16 (C-7), 85.19 (C-14), 77.74 (C-20), 77.55 (C-22), 77.45 (C-24), 68.70 (C-2), 68.51 (C-3), 51.79 (C-5), 50.44 (C-17), 48.58 (C-13), 39.26 (C-10), 37.36 (C-1), 35.74 (C-23), 35.09 (C-9), 34.10 (C-25), 32.87 (C-4), 32.49 (C-12), 31.77 (C-15), 24.41 (C-19), 21.54 (C-16), 21.54 (C-11), 20.95 (C-21), 19.36 (C-27), 18.05 (C-18), 16.97 (C-26)。上述数据与文献(梅文莉等，2006)基本一致，故鉴定为pterosterone。

化合物白色无定型粉末，分子式为CHO。ESI-MS：523 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 6.94 (1H, s, H-2′), 6.92 (1H, s, H-6′), 6.61～6.55 (3H, overlap, H-2, 7′, 5), 6.49 (1H, dd,=8.0, 2.0 Hz, H-6), 6.31 (1H, dt,=15.8, 5.7 Hz, H-8′), 4.69 (1H, d,=7.5 Hz, H-1″), 4.23 (2H, d,=5.7, H-9′a, 9′b), 4.02～3.93 (1H, m, H-8), 3.84 (3H, s, OCH-3′), 3.78 (2H, overlap, H-9a, 6″a), 3.70 (3H, s, OCH-3), 3.68 (2H, overlap, H-9b, 6″b), 3.49～3.39 (3H, overlap, H-2″, 3″, 4″), 3.16～3.11 (1H, m, H-5″), 2.98 (1H, dd,=13.8, 5.6 Hz, H-7a), 2.73 (1H, dd,=13.8, 9.3 Hz, H-7b)。C NMR (125 MHz, CDOD): 153.46 (C-3′), 148.41 (C-3), 145.36 (C-4), 144.99 (C-4′), 138.96 (C-5′), 135.38 (C-1′), 133.19 (C-1), 131.50 (C-7′), 129.64 (C-8′), 122.58 (C-6), 119.13 (C-6′), 115.64 (C-2), 113.71 (C-5), 109.06 (C-2′), 105.35 (C-1″), 78.09 (C-3″), 77.87 (C-5″), 75.95 (C-2″), 71.24 (C-4″), 66.82 (C-9), 63.68 (C-9′), 62.44 (C-6″), 56.35 (C-10), 56.22 (C-10′), 42.81 (C-8), 39.17 (C-7)。上述数据与文献(Van et al., 2008)基本一致，故鉴定为icariside E。

化合物白色无定型粉末，分子式为CHO。ESI-MS：525 [ M+H ]，H NMR (600 MHz, CDOD): 6.71 (2H, br s, H-2′, 6′), 6.56～6.52 (2H, m, H-2, 5), 6.46 (1H, dd,=8.1, 2.0 Hz, H-6), 4. 60 (1H, d,= 7.2 Hz, H-1″), 3.95 (1H, m, H-8), 3. 82(1H, m, H-6″a), 3.79 (3H, s, 3′- OCH), 3.76(1H, m, H-9a), 3.74 (1H, m, H-6″b), 3.68 (3H, s, 3-OCH), 3. 65(1H, m, H-9b), 3.56 (2H, t,=6.4 Hz, H-9′a, H-9′b), 3. 44(1H, m, H-3″), 3. 40 (1H, m, H-2″), 3. 32 (1H, m, H-4″), 3.11 (1H, ddd,=8.6, 5.3, 2.4 Hz, H-5″), 2.97 (1H, dd,=13.8, 5.5 Hz, H-7a), 2.70 (1H, dd,=13.8, 5.5 Hz, H-7b), 2.63(2H, t,=7.8 Hz, H-7′a, H-7′b), 1.85～1.76 (2H, m, H-8′a, H-8′b)。C NMR (150 MHz, CDOD): 153.10 (C-3′), 148.38 (C-3), 145.29 (C-4), 143.57 (C-4′), 140.33 (C-1′), 138.54 (C-5′), 133.34 (C-1), 122.58 (C-6), 120.33 (C-6′), 115.61 (C-2), 113.63 (C-5), 111.70 (C-2′), 105.58 (C-1″), 78.06 (C-3″), 77.87 (C-5″), 75.95 (C-2″), 71.23 (C-4″), 67.08 (C-9), 62.46 (C-6″), 62.20 (C-9′), 56.31 (C-10), 56.22 (C-10′), 42.79 (C-8), 39.21 (C-7), 35.59 (C-8′), 33.14 (C-7′)。上述数据与文献(李慧娟等，2014)基本一致，故鉴定为icariside E。

化合物黄色固体，分子式为CHO。ESI-MS：419 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 6.67 (4H, s, H-2, 6, 2′, 6′), 4.73 (2H, d,=4.1 Hz, H-7, 7′), 4.36～4.20 (2H, m, H-9), 3.89 (2H, dd,=9.1, 3.5 Hz, H-9′), 3.86 (12H, s, -OCH×4), 3.18～3.12 (2H, m, H-8, 8′)。C NMR (125 MHz, CDOD): 149.35 (C-3′, 5′, 3″, 5″), 136.19 (C-4′, 4″), 133.13 (C-1′, 1″), 104.49 (C-2′, 6′, 2″, 6″), 87.63 (C-2, 6), 72.76 (C-4, 8), 56.79 (C-3′, 5′, 3″, 5″-OCH), 55.52 (C-1, 5)。上述数据与文献(Wang et al., 2009)一致，故鉴定为(+)-syringaresinol。

化合物黄色固体，分子式CHO。ESI-MS：359 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 6.96 (2H, d,=2.0 Hz, H-2, 2′), 6.82 (2H, dd,=8.2, 2.0 Hz, H-6, 6′), 6.78 (2H, d,=8.1 Hz, H-5, 5′), 4.72 (2H, d,=4.3 Hz, H-7, 7′), 4.24 (2H, dd,=9.0, 6.8 Hz, H-9, 9′), 3.87 (6H, s, -OCH×2), 3.85 (2H, dd,=9.0, 3.6 Hz, H-9, 9′), 3.15 (2H, m, H-8,8′)。C NMR (125 MHz, CDOD): 149.13 (C-3, 3′), 147.33 (C-4, 4′), 133.80 (C-1, 1′), 120.06 (C-6, 6′), 116.07 (C-5, 5′), 110.97 (C-2, 2′), 87.53 (C-7, 7′), 72.61 (C-9, 9′), 56.40 (C-OCH×2), 55.38 (C-8, 8′)。上述数据与文献(In et al., 2015)基本一致，故鉴定为pinoresinol。

化合物无定型粉末，分子式为CHO。ESI-MS：371 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 6.98 (1H, d,=2.0 Hz, H-3′), 6.95 (1H, d,=1.9 Hz, H-3), 6.85 (1H, dd,=7.8, 1.8 Hz, H-5′), 6.84 (1H, dd,=7.8, 1.8 Hz, H-5), 6.83 (1H, d,=7.8, H-6′), 6.80 (1H, d,=7.8, H-6), 5.40 (1H, d,=3.9 Hz, H-7′), 5.24 (1H, d,=3.9 Hz, H-7), 4.30 (1H, dd,=9.4, 6.9 Hz, H-9′), 4.04 (1H dd,=9.5, 6.9 Hz, H-9′), 3.88 (3H, s, 2′-OCH), 3.87 (3H, s, 2-OCH), 3.67 (1H, m, H-8′), 3.40～3.34 (1H, m, H-8)。C NMR (125 MHz, CDOD): 179.69 (C-9), 149.39 (C-2′), 149.18 (C-2), 148.27 (C-1′), 147.49 (C-1), 133.19 (C-4′), 132.39 (C-4), 119.79 (C-5′), 119.50 (C-5), 116.43 (C-6′), 116.16 (C-6), 110.59 (C-3′), 109.69 (C-3), 87.18 (C-7′), 85.09 (C-7), 73.80 (C-9′), 56.48 (C-2′), 56.33 (C-2), 54.45 (C-8′), 51.02 (C-8)。上述数据与文献(Ma et al., 2013)基本一致，故鉴定为balanophonin B。

化合物白色固体，分子式为CHON。ESI-MS：336 [ M+Na]，H NMR (500 MHz, CDOD): 7.43 (1H, d,=15.7 Hz, H-8′), 7.11 (1H, d,=2.0 Hz, H-2′), 7.05 (2H, d,=8.4 Hz, H-2, 6), 7.02 (1H, dd,=8.2, 2.0 Hz, H-6′), 6.79 (1H, d,=8.2 Hz, H-5′), 6.71 (2H, d,=8.4 Hz, H-3, 5), 6.40 (1H, d,=15.7 Hz, H-7′), 3.88 (3H, s, -OCH), 3.46 (2H, dd,=8.0, 6.8 Hz, H-8), 2.75 (2H, t,=7.4 Hz, H-7)。C NMR (125 MHz, CDOD): 169.19 (C-9′), 156.95 (C-4), 149.98 (C-4′), 149.32 (C-3′), 142.05 (C-7′), 131.29 (C-1), 130.73 (C-2, 6), 128.19 (C-1′), 123.24 (C-6′), 118.66 (C-8′), 116.49 (C-5′), 116.26 (C-3, 5), 111.50 (C-2′), 56.36 (C-OCH), 42.55 (C-8), 35.81 (C-7)。上述数据与文献(Kan et al., 2011)基本一致，故鉴定为--feruloyl tyramine。

化合物无色针晶，分子式CHO。ESI-MS：197 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 5.76 (1H, s, H-7), 4.31～4.13 (1H, m, H-3), 2.43 (1H, dt,=14.0, 2.5 Hz, H-4), 2.00 (1H, dd,=14.3, 2.3 Hz, H-2), 1.77 (3H, s, CH-9), 1. 74( 1H, dd,=14.0, 4.0, H-4), 1.54 (1H, dd,=14.4, 3.7 Hz, H-2), 1.48 (3H, s, CH-10 ), 1.28 (3H, s, CH-11)。C NMR (125 MHz, CDOD): 185.69 (C-8), 174.44 (C-6), 113.34 (C-7), 88.96 (C-5), 67.25 (C-3), 47.98 (C-4), 46.44 (C-2), 37.19 (C-1), 31.02 (C-9), 27.43 (C-11), 26.96 (C-10)。上述数据与文献(李燕等，2010)基本一致，故鉴定为(-)-loliolide。

化合物白色片晶，CHO。ESI-MS：255 [M-H]，H NMR (500 MHz, CDCl): 2.32 (2H, t,=7.5 Hz, -CH-COOH), 1.62 (2H, m,=7.5 Hz, -CH-CH-CH), 0.87 (3H, t,=6.9 Hz, -CH-CH)。C NMR (125 MHz, CDCl): 177.68 (s), 33.97 (t), 32.06 (t),29.82 (t), 29.8 (t)1, 29.79 (t), 29.73 (t), 29.59 (t), 29.50 (t), 29.40 (t), 29.24 (t), 24.92 (t), 22.83 (t), 14.25 (q)。上述数据与文献(高幼衡等，2002)基本一致，故鉴定为棕榈酸(palmitic acid)。

2.2 抗炎活性测试结果

利用MTS法检测细胞活力发现，与阴性对照组相比，浓度为50 μmol·L时，所测化合物的细胞活力均大于100%，表明所测化合物对RAW 264.7细胞均无细胞毒性(图2：A)。

图 1 化合物1-16的结构式Fig. 1 Structural formulas of compounds 1-16

LPS、Dex、化合物测试浓度分别为1 μg·mL-1、10 μmol·L-1和50 μmol·L-1。与LPS组相比，** P< 0.01。LPS, Dex, compounds were tested at a concentration of 1 μg·mL-1, 10 μmol·L-1 and 50 μmol·L-1 respectively. Compared with LPS group, ** P< 0.01.图 2 化合物1-16对RAW 267.1细胞活力(A)及对LPS刺激细胞产生NO(B)的影响Fig. 2 Effects of compounds 1-16 on cell viability (A) and NO production stimulated by LPS in RAW 264.7 cells (B)

利用炎症模型评价发现，与空白组相比，LPS组的NO释放量显著增高，表明造模成功。与 LPS 组相比，在50 μmol·L的浓度下，化合物、、无明显抑制NO生成作用；化合物、、均能在一定程度上抑制NO生成；其中，化合物、、-抑制NO产生的能力与浓度为10 μmol·L的地塞米松相当(图2：B)；进一步对其进行浓度梯度筛选，结果表明，化合物、、-对NO产生的抑制率均呈浓度依赖，IC值分别为18.63、40.76、21.46、14.32、16.82、42.31 μmol·L。

3 讨论与结论

本研究通过对拔毒散样品分离纯化，共鉴定16个化合物，涵盖了较多种类的化合物类型，包括黄酮类3个(化合物-)、甾体类蜕皮激素5个(化合物-)、苯丙素类2个(化合物、)、木脂素类3个(化合物)、酰胺类1个(化合物)、单萜类1个(化合物)以及脂肪酸类1个(化合物)。其中，化合、、均为在该植物中首次分离得到。

炎症反应是机体受到体内或体外因素的刺激而引发的应激防御性反应，与临床中其他病理过程的发生关系密切(于玲玲等，2021)。本研究利用LPS诱导RAW 264.7细胞产生NO为评价模型，综合化合物结构类型，发现拔毒散中主要抗炎活性成分为木脂素类化合物，且属于双四氢呋喃型木脂素。已有研究表明，双四氢呋喃型木脂素在抗炎、抗肿瘤、抗氧化、神经保护以及抗病毒等方面具有较好的活性(于淼等，2013)，其中的抗炎活性在本实验中得到验证，但该类成分抗炎活性的构效关系尚不明确。此外，在本研究中，拔毒散中含量较高的蜕皮激素类化合物抗炎效果并不理想。其他研究表明，该类化合物在抗氧化、防止内皮细胞损伤以及促进表皮细胞分化等方面具有一定作用(赵一璐等，2010)。综上，通过抗炎和组织细胞修复等方式，拔毒散在傣族民间治疗诸疮肿毒、皮肤瘙痒、跌打损伤、刀枪伤等症状的用法有一定的科学依据。

本研究丰富了拔毒散的化学成分，明确了其具有抗炎效果的物质基础，验证了其在民间用法的科学性，为其进一步开发利用提供了思路及科学依据。