锑对土壤中秀丽隐杆线虫的毒性效应

2022-10-14宋子杰党秀丽赵龙侯红王鑫吕海洋

农业环境科学学报 2022年9期

宋子杰，党秀丽，赵龙，侯红，王鑫，吕海洋

（1.沈阳农业大学土地与环境学院，农业农村部东北耕地保育重点实验室，土肥资源高效利用国家工程实验室，沈阳 110866；2.中国环境科学研究院，环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012）

锑（Sb）是类金属元素，没有已知的生物学功能，对人体具有毒害甚至致癌作用，自1979年以来一直被美国环境保护局（EPA）和欧盟（EU）视为重点污染物。Sb在半导体、阻燃剂、硬化剂、电池生产等方面被广泛使用，受近年来采矿冶炼作业、废弃物焚化、煤炭燃烧、工业生产等人类活动的影响，环境中的Sb含量显著增加。至2020年，中国Sb产量近8万t，已成为全球最大的Sb产量国。广西河池市的铅锑矿冶炼厂区域土壤中Sb含量最高可达到3 690 mg·kg，湖南省锡矿山区域的土壤中平均Sb含量为3 061 mg·kg，最高可达到16 389 mg·kg，土壤Sb污染已成为不容忽视的环境问题。

生态安全土壤环境基准是土壤环境质量标准制定的基础，该基准的推导需要陆生植物、微生物、土壤无脊椎动物等的毒性阈值作为支撑。近年来，国内外陆续开展了Sb对土壤环境中生态受体的毒性阈值研究。ZHONG等研究发现酸性土壤中Sb对赤子爱胜蚓（）的LC（半数致死浓度）为497 mg·kg；LIN等评价了老化7 d和60 d的土壤中外源Sb对白符跳（）的毒性，通过计算得出Sb对白符跳繁殖毒性的EC（半数效应浓度）分别达到307 mg·kg和1 419 mg·kg。但相关阈值研究依旧是基于有限的土壤环境生态受体。天然土壤的性质（土壤pH、阳离子交换量、有机质含量、金属氧化物含量等）存在不同程度的差异，从而会影响土壤中重金属的毒性。我国土壤环境基准研究起步较晚，基于不同类型土壤进行的毒性阈值研究较少，从而导致研究基础数据较为匮乏。

目前Sb对土壤无脊椎动物毒性的阈值研究主要集中于跳虫和蚯蚓，而对线虫毒性的阈值研究较为不足。模式生物秀丽隐杆线虫（）因具有生命周期短和易在实验室条件下培养的特点而被广泛应用于毒理学研究，基于国际标准ISO 10872指南的线虫毒性试验被认为是评价污染物毒性的有力工具。MOYSON等的研究结果表明，经过48 h的重金属Zn、Cu、Cd溶液毒性暴露，3种重金属对线虫的LC分别为16.380、0.884、20.765 mg·kg；LU等将线虫暴露于不同浓度的Mn、Pb、Cd溶液24 h，结果发现3种重金属对线虫的LC分别为41.4、0.26、4.8 mmol·L。但相关研究多基于水体介质中重金属污染物对线虫的毒性，而基于土壤介质中重金属污染物的线虫毒性试验相对缺乏。因此，本研究以秀丽隐杆线虫为受试生物，选用3种理化性质各异的土壤（西安垆土、鹰潭红壤、江门红壤），研究外源Sb对线虫生长、生育、繁殖的毒性效应和阈值，并进一步探究影响Sb毒性的主要土壤理化性质，为基于土壤无脊椎动物的Sb毒性预测模型建立和土壤环境质量标准的修订提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

供试土壤分别采集于中国陕西省西安市（XA）、江西省鹰潭市（YT）、广东省江门市（JM）的农田表层（0～20 cm）。土壤于自然条件下风干、剔除其中的石块和动植物残体后过2 mm筛网备用。土壤中黏粒占比通过激光粒度仪测定；田间持水量采用环刀法测定（NY/T 1121.22—2010）；土壤pH采用电极法测定（土水比为∶=1∶5，NY/T 1137—2007）；土壤阳离子交换量采用非缓冲硫脲银法测定；土壤中有机质含量采用重铬酸钾氧化法测定；土壤中碳酸钙含量采用中和滴定法测定；土壤经过草酸铵缓冲溶液[0.1 mol·LHCO和0.175 mol·L（NH）CO]提取处理后测定非晶质铁氧化物、非晶质锰氧化物和非晶质铝氧化物的含量；2 g土壤经20 mL 0.3 mol·LCHNaO、2.5 mL 1 mol·LNaHCO和0.5 g NaSO提取处理后测定晶质铁氧化物、晶质锰氧化物和晶质铝氧化物的含量；土壤经过HF-HClO-HNO（∶∶=3∶1∶1）消解处理后测定土壤中Sb的背景含量。供试土壤理化性质如表1所示。

表1 供试土壤理化性质Table 1 Physicochemical properties of the tested soils

1.2 供试生物

野生型秀丽隐杆线虫N2株和大肠杆菌（）OP50株均由福建上源生物科技有限公司提供。线虫在恒温培养箱中（20±1）℃条件下培养于线虫生长培养基（Nematode growth-medium，NGM）琼脂中。NGM琼脂制备方法：17 g·L琼脂粉、2.5 g·L酪蛋白胨和3 g·LNaCl于121℃条件下高压灭菌后，加入无菌的1 mL 1 mol·LCaCl、1 mL 1 mol·LMgSO、25 mL 1 mol·LKHPO（用KOH调节pH为6.0±0.2）和1 mL 5 g·L胆固醇乙醇溶液，用无菌水定容至1 000 mL并充分混匀后，倒入培养皿冷却备用。以大肠杆菌OP50株作为线虫食物源，大肠杆菌菌液制备方法：从持续培养的LB（Luria-Bertani）固体培养基（17 g·L琼脂粉、10 g·L酪蛋白胨、5 g·L酵母抽提物和10 g·LNaCl于121℃条件下高压灭菌后，倒入培养皿冷却制得）上挑取单克隆大肠杆菌菌落至LB液体培养基（10 g·L酪蛋白胨、5 g·L酵母抽提物和10 g·LNaCl于121℃条件下高压灭菌，冷却后制得），于恒温摇床中37℃、150 r·min条件下培养14 h，用于线虫的培养和毒性试验。

为降低线虫个体差异对试验的影响，试验前需要进行线虫的同步化培养。待NGM琼脂表面分布大量产卵的成虫时，将线虫以M9缓冲液（33.71 mmol·LNaHPO、22 mmol·LKHPO、85.56 mmol·LNaCl和1 mmol·LMgSO）冲洗至离心管，并洗去线虫体表残余的大肠杆菌，向离心管内加入裂解液（2.5 mol·LNaOH和质量分数为5%的NaClO）以裂解线虫身体获得虫卵。用M9缓冲液洗去虫卵表面多余的裂解液后，将虫卵置于M9缓冲液中培养14 h即可获得年龄同步的第一阶段线虫幼虫。

1.3 土壤中Sb的添加和老化

试验选用的三价锑盐为酒石酸锑钾，CHKOSb·3HO，分析纯。土壤中Sb的添加以喷施酒石酸锑钾水溶液的方式进行，每种土壤中的理论总Sb含量分别达到300、600、1 200、2 400、4 800 mg·kg，对照组仅添加去离子水。土壤充分搅拌均匀，调节土壤含水量至田间持水量的55%～60%后，装入半封口的自封袋中老化备用，期间通过称量的方法向自封袋中补充去离子水以保持土壤水分。经过7 d的老化后，取土壤样品进行线虫毒性试验和总Sb、有效态Sb、不同价态Sb含量的测定。

1.4 土壤中线虫毒性试验

毒性试验根据国际标准ISO 10872指南和SACCÀ等的方法进行。称取0.5 g老化7 d的风干土壤至孔板中，加入0.1 mL重悬于M9缓冲液的大肠杆菌菌液（15 mg·mL）作为线虫的食物源，向土壤中补充M9缓冲液使土壤含水量保持在田间持水量的80%，以保证试验期间线虫的水分需求。使用毛细管（直径0.1 mm）向孔板内的土壤中添加10条线虫后密封，置于恒温培养箱中（20±1）℃黑暗条件下培养96 h。培养结束后，将孔板置于80℃恒温干燥箱中加热杀死线虫以终止试验，通过Ludox TM50离心悬浮法将孔板中的所有线虫回收于培养皿中。每个试验处理4次重复。

回收的线虫置于100倍显微镜下测量线虫的体长以计算线虫的生长量，取30条第一阶段线虫幼虫的平均体长作为线虫的初始体长，为（276.2±8.5）µm。生长量的计算公式：

式中：为生长量，µm；为试验结束时的线虫体长，µm；为线虫初始体长，µm。

于40倍显微镜下计数具有生育能力的线虫个体数量（线虫体内虫卵个数≥1，则认为具有生育能力）以计算线虫的生育率。生育率的计算公式：

式中：为生育率，%；为具有生育能力的线虫个体数量，条；为引入试验的线虫个体数量，条。

于40倍显微镜下计数线虫后代个体数量以计算线虫的繁殖力。繁殖力的计算公式：

式中：为繁殖力；为线虫后代个体数量，条；为引入试验的线虫个体数量，条。

1.5 土壤总Sb、有效态Sb和不同价态Sb含量的测定

经过7 d的老化后，取土壤样品测定总Sb、有效态Sb和不同价态Sb的含量。土壤总Sb含量的测定参考YAN等的方法：称取过0.075 mm尼龙筛网的风干土壤0.1 g，经过HF-HClO-HNO（∶∶=2∶1∶3）消解后通过0.5%的HNO稀释并过滤，通过电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定滤液中Sb的含量。土壤中有效态Sb含量的测定参考ETTLER等的方法：称取2 g过2 mm尼龙筛网的风干土壤于离心管中，加入20 mL 0.1 mol·LNaHPO，于恒温水浴振荡器中25℃、200 r·min条件下振荡2 h，再将离心管置于离心机中4 000 r·min条件下离心10 min后过0.45 µm滤膜，通过电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定滤液中Sb的含量。土壤中不同价态Sb含量的测定参考LIN等的方法：称取0.5 g过2 mm尼龙筛网的风干土壤于离心管中，加入5 mL 0.1 mol·LCHO，于恒温水浴振荡器中60℃、200 r·min条件下振荡30 min后过0.45µm滤膜，通过氢化物发生-原子荧光光谱仪（HG-AFS）测定滤液中三价锑[Sb（Ⅲ）]和五价锑[Sb（Ⅴ）]的含量。测定过程使用国家一级标准物质（GBW-47410）作为质控。

1.6 数据处理与分析

通过Logisitic方程拟合实测总Sb含量和有效态Sb含量与线虫各个毒性评价终点之间的剂量-效应关系并计算EC：

以计算Sb对线虫生长毒性的EC为例，式中：为线虫的生长量，µm；为实测总Sb含量或有效态Sb含量，mg·kg；为对照组中线虫的生长量，µm；为EC值，mg·kg；b为方程拟合过程中所产生的斜率参数。Sb对线虫生育或繁殖毒性的EC的计算方式同上，将替换为生育率或繁殖力，替换为对照组中线虫的生育率或繁殖力。

Logisitic方程的拟合通过Sigmaplot 14.0软件完成，相关性分析和单因素方差分析通过SPSS 25.0软件完成，利用OriginPro 2018和Excel 2019软件进行图表的制作。

2 结果与分析

2.1 土壤中Sb（Ⅴ）占总Sb的比例

Sb（Ⅲ）在土壤中被吸附的同时还会被氧化为Sb（Ⅴ）。由图1可知，理论总Sb含量为300 mg·kg时，西安垆土、鹰潭红壤和江门红壤中分别有42.4%、30.0%、68.0%的Sb（Ⅲ）被氧化为Sb（Ⅴ）。随着理论总Sb含量的提高，3种土壤中Sb（Ⅲ）的氧化效率呈下降趋势。整体而言，江门红壤中Sb（Ⅲ）表现出最高的氧化效率，西安垆土次之，鹰潭红壤最低。

图1 土壤中Sb（Ⅴ）占总Sb的比例Figure 1 Proportion of Sb（Ⅴ）in total Sb in soils

2.2 土壤中有效态Sb含量

重金属的有效态含量能够反映土壤重金属的潜在危害。总体而言，3种土壤中的有效态Sb含量均随外源Sb含量的增加而增加，相同外源Sb含量下，3种土壤有效态Sb含量均存在显著差异（图2）。理论总Sb含量为4 800 mg·kg时，西安垆土、鹰潭红壤和江门红壤中最高有效态Sb含量分别达到448.1、258.6、95.3 mg·kg。有效态Sb的提取比例由高到低依次为西安垆土10.9%（9.4%～13.7%）、鹰潭红壤6.2%（4.7%～9.1%）、江门红壤2.6%（1.9%～3.2%）。

图2 土壤中有效态Sb含量Figure 2 Concentration of Na2HPO4-extracted Sb in soils

2.3 Sb对线虫毒性的效应及阈值

于线虫毒性试验结束后进行试验的有效性检验：对照组的线虫平均回收率在80%～100%范围内；未发现雄性线虫；线虫生长量和生育率的变异系数均低于15%，线虫繁殖力的变异系数低于30%；线虫的平均生育率高于80%；线虫的平均繁殖力高于50。因此，本试验符合国际标准ISO 10872指南中关于试验有效性的要求。

2.3.1 Sb对线虫生长毒性的效应及阈值

利用Logistic方程拟合土壤中实测总Sb含量、有效态Sb含量与线虫生长量间的剂量-效应关系，结果如图3所示。3种土壤中线虫的生长量均随着理论总Sb含量的增加逐渐降低，但下降趋势存在差异。西安垆土、鹰潭红壤、江门红壤中理论总Sb含量分别达到600、1 200、2 400 mg·kg时，线虫的生长量相较于对照组开始出现显著降低（＜0.05）；理论总Sb含量提高至4 800 mg·kg时，江门红壤中线虫的生长量仍达到416.4µm，而西安垆土和鹰潭红壤中线虫的生长量分别仅达到185.9、194.5 µm。基于实测总Sb含量计算得出，西安垆土、鹰潭红壤、江门红壤中Sb对线虫生长毒性的EC分别为1 138、2 163、4 074 mg·kg，最大毒性是最小毒性的3.6倍；基于有效态Sb含量计算得出，西安垆土、鹰潭红壤、江门红壤中Sb对线虫生长毒性的EC分别为116.5、107.0、81.8 mg·kg，最大毒性是最小毒性的1.4倍，差异有所降低（表2）。2.3.2 Sb对线虫生育毒性的效应及阈值

图3 线虫生长量与实测总Sb和有效态Sb含量的剂量-效应关系Figure 3 Dose-response relationships of the growth of C.elegans with the measured concentrations of total Sb and Na2HPO4-extracted Sb

由图4可知，理论总Sb含量在0～600 mg·kg的范围内时，3种土壤中线虫的生育率均未受到Sb毒性的影响（0.05）；理论总Sb含量达到1 200 mg·kg时，西安垆土和鹰潭红壤中线虫的生育率开始受到显著抑制（＜0.05），而江门红壤中线虫的生育率未受到显著的毒性影响（0.05）；理论总Sb含量进一步提高至2 400 mg·kg时，江门红壤中线虫的生育率出现显著降低（＜0.05），但是仍有74%的线虫具有生育能力，而西安垆土和鹰潭红壤中线虫的生育率不足10%。基于实测总Sb含量计算得出，西安垆土、鹰潭红壤、江门红壤中Sb对线虫生育毒性的EC分别为849、1 472、3 244 mg·kg，最大毒性是最小毒性的3.8倍；基于有效态Sb含量计算得出，西安垆土、鹰潭红壤、江门红壤中Sb对线虫生育毒性的EC分别为92.1、79.2、67.9 mg·kg，最大毒性是最小毒性的1.4倍，差异有所降低（表2）。

图4 线虫生育率与实测总Sb和有效态Sb含量的剂量-效应关系Figure 4 Dose-response relationships of the fertility of C.elegans with the measured concentrations of total Sb and Na2HPO4-extracted Sb

表2 基于实测总Sb和有效态Sb含量推导的Sb对线虫毒性的EC50Table 2 The EC50 values of Sb for the toxicity of C.elegans based on the concentration of measured total Sb and Na2HPO4-extracted Sb

2.3.3 Sb对线虫繁殖毒性的效应及阈值

通过对线虫繁殖力的统计结果发现（图5），西安垆土中理论总Sb含量达到600 mg·kg时线虫的繁殖受到显著的毒性抑制（＜0.05），而鹰潭红壤和江门红壤中理论总Sb含量达到1 200 mg·kg时线虫的繁殖力开始出现显著降低（＜0.05）；理论总Sb含量提高至2 400 mg·kg时，西安垆土和鹰潭红壤中几乎没有新的线虫后代个体产生，而江门红壤中每条线虫仍然能产生13.9个后代个体。基于实测总Sb含量计算得出，西安垆土、鹰潭红壤、江门红壤中Sb对线虫繁殖毒性的EC分别为574、836、1 470 mg·kg，最大毒性是最小毒性的2.6倍；基于有效态Sb含量计算得出，西安垆土、鹰潭红壤、江门红壤中Sb对线虫繁殖毒性的EC分别为69.1、48.6、34.7 mg·kg，最大毒性是最小毒性的2.0倍，差异所有降低（表2）。

图5 线虫繁殖力与实测总Sb和有效态Sb含量的剂量-效应关系Figure 5 Dose-response relationships of the reproduction of C.elegans with the measured concentrations of total Sb and Na2HPO4-extracted Sb

2.4 土壤理化性质与Sb毒性阈值间的相关性

通过Pearson相关性分析进一步探究影响Sb毒性的主要因素，根据分析结果可以发现（表3）：阳离子交换量与Sb对线虫生育的EC呈显著正相关（＜0.05）；有机质含量与Sb对线虫生育和繁殖的EC呈显著正相关（＜0.05）；非晶质铁氧化物含量与Sb对线虫生长的EC呈显著正相关（＜0.05）。以上结果表明，土壤阳离子交换量、有机质含量和非晶质铁氧化物含量是影响Sb毒性的重要因素，这是因为阳离子交换量较高的土壤具有更多的点位以吸附环境中的Sb，从而降低了Sb的生物有效性，有机质和非晶质铁氧化物对土壤中Sb的吸附和对Sb（Ⅲ）的氧化作用能够降低Sb的毒性。

表3 土壤理化性质与Sb毒性阈值间的相关性Table 3 Correlation between threshold of Sb toxicity to C.elegans and soil physicochemical properties

3 讨论

基于国际标准ISO 10872指南的线虫毒性试验涵盖了秀丽隐杆线虫的整个生命周期，因此可以通过该试验方法确定对线虫个体水平（生长和生育）以及种群水平（繁殖）的影响。本研究结果表明，线虫的毒性评价终点对Sb毒性的敏感性由高到低依次为繁殖力、生育率、生长量。BYERLY等研究发现，于20℃的培养条件下线虫的生长过程经历4次蜕皮且体长达到1 060 µm时，线虫开始产卵。如果线虫的生长受到Sb毒性的抑制而不能达到生育所需的生长阶段，Sb对线虫生育的抑制可能是线虫生长受到抑制的附加效应。因此，线虫的生育对Sb毒性表现出高于生长的敏感性，是Sb对线虫生育的直接影响和对线虫生长毒性的附加效应共同造成的。SCHERTZINGER等研究发现，线虫的生育在没有受到钯（Pd）毒性完全抑制的情况下，繁殖受到完全的抑制，这可能是由Pd对线虫虫卵的损害以及生育毒性的附加效应共同造成的，从而导致线虫的繁殖对污染物毒性的敏感性高于生育和生长。本研究结果还发现，理论总Sb含量达到4 800 mg·kg的鹰潭红壤中没有新的线虫后代个体产生，但是线虫的生育并没有受到完全抑制。因此，线虫的繁殖对Sb毒性表现出最高的敏感性，可能是由Sb对线虫繁殖过程的直接影响和对线虫生育毒性的间接影响所致。

理化性质各异的土壤中Sb的环境行为不同，从而导致了土壤中Sb毒性的差异。CAI等的研究指出，Sb在土壤中的反应过程大致可以分为：Sb（Ⅲ）迁移至土壤表面被吸附点位吸附，在土壤表面被氧化为Sb（Ⅴ）并被重新释放入土壤溶液后，再次被土壤中的其他吸附点位吸附。本研究结果表明，阳离子交换量、有机质含量和非晶质铁氧化物含量是影响Sb毒性的重要因素。相关研究表明，有机质和金属氧化物能够与Sb结合形成配合物并促进高毒性的Sb（Ⅲ）被氧化为毒性较低的Sb（Ⅴ）。本研究所选用的江门红壤中有机质和非晶质铁氧化物含量较高，为外源添加的Sb（Ⅲ）提供充足吸附点位的同时促进了高毒性的Sb（Ⅲ）向低毒性的Sb（Ⅴ）转化并再次吸附，从而导致江门红壤中Sb表现出对线虫最低的毒性。研究发现，OH能够提供电子并增强金属的还原性，因此土壤中较高的pH能够促进Sb（Ⅲ）被氧化为Sb（Ⅴ）。西安垆土中Sb（Ⅴ）占总Sb比例高于鹰潭红壤，正是因为西安垆土具有较高的土壤pH。也有研究表明，OH与Sb竞争土壤中的吸附位点，因此具有较高pH的土壤不利于Sb的吸附，即生物有效含量较高，该结果同样能够解释西安垆土具有最高的有效态Sb含量的原因。LIN等的研究同样发现，不同土壤中Sb对线虫繁殖毒性的EC与阳离子交换量呈显著正相关，这是因为阳离子交换量是土壤中可用吸附点位数量的一种度量，是由土壤黏粒、pH、有机质、金属氧化物等吸附相共同决定的。林祥龙等的研究表明，水提取态Sb同样能够较好地解释不同土壤中Sb对白符跳繁殖毒性的显著差异，其研究结果显示基于土壤总Sb含量计算的Sb对白符跳繁殖毒性的EC差异高达5.9倍，而基于水提取态Sb含量计算的EC差异降低至3.2倍；何飞等研究发现基于有效态Sb含量计算的Sb对不同土壤中甘蓝根伸长毒性的EC在8.28～24.05 mg·kg范围内，EC间的差异相较基于总Sb含量计算的EC（100.55～656.65 mg·kg）缩小。