金钟花总黄酮提取工艺及抗氧化活性研究*

陈志红，龚海燕，崔永霞，雷敬卫，李伟峰

河南中医药大学，河南 郑州 450046

金钟花(ForsythiaviridissimaLindl.)为木樨科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)落叶灌木，亦称单叶连翘，迎春条等。其主要分布在江苏、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南等省，现在多作为城市景观植物。金钟花味苦、性凉，花、根、叶和果实均可入药，具有解毒、散结的功效，在江苏、安徽和浙江等地广泛使用，主要治疗感冒发热和目赤肿痛等[1-2]。

金钟花与连翘同科同属，研究表明连翘属植物中主要含黄酮类、萜类和苷类等成分，黄酮类化合物广泛存在于植物体内，具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗癌等多种生物活性[3-6]。近年来金钟花受到越来越多学者的关注。江月锋[7]将金钟花研制成保健酒治疗腰椎间盘突出并取得不错的经济效益；王桃云等[8]对金钟花黄色素的提取工艺进行优化研究；蒋本国等[9]和刘会超等[10]从金钟花花瓣中提取花色素与花色苷作为一种天然色素广泛应用于食品和化妆品等行业；有关金钟花有效成分[11-12]和生药学鉴定方面[13-14]的研究较多，但对金钟花中总黄酮的提取工艺及其抗氧化活性研究鲜少报道。超声辅助提取法操作简单、设备便宜，具有提取时间短，温度易控，提取效率高等优点[15]。基于此，本实验通过超声辅助提取结合响应面法，考察不同要素对金钟花总黄酮得率的影响，对金钟花中总黄酮提取工艺进行优化，并测定金钟花总黄酮提取液清除DPPH自由基的能力[16]，为金钟花资源的合理开发应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器金钟花采自河南中药植物园，经河南中医药大学生药教研室王利丽副教授鉴定为金钟花(ForsythiaviridissimaLindl.)。将金钟花鲜品，去除枝叶，阴干打粉，过80目筛，密封保存至干燥器中备用。

芦丁对照品购自上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：Y06J8S 37439；抗坏血酸(Vc)购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司，纯度≥99.7%，批号：MBIC105；DPPH(2，2-联苯基-1-苦基肼基)购自罗恩试剂，批号：R051727-100；Al(NO3)3、NaNO2、NaOH、无水乙醇均为分析纯，购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；超纯水实验室自制。

UV-2600型紫外-可见分光光度计：日本岛津；Spectra Max iD3型酶标仪：美谷分子仪器(上海)有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DHG-9240型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；JP-100A型高速多功能粉碎机：永康市久品工贸有限公司；AB135-S十万分之一分析天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；FA2004B 万分之一分析天平：上海精科天美科学仪器有限公司；超纯水机 ELGA Centra R200：UK；100～1000 μL移液枪：艾本德中国有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁的标准曲线制备称取干燥至恒质量的芦丁对照品305.26 mg，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇定容，即得0.01 mol·L-1芦丁对照品溶液。精密移取此溶液0.65 mL于20 mL容量瓶中，加60%乙醇定容，混匀，得0.2 g·L-1芦丁对照品溶液，冷藏，备用。参考文献[17]和预实验，确定以510 nm作为检测波长。精密移取芦丁对照品溶液0.00 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、3.50 mL，分别置于10 mL容量瓶中，依次加入60%乙醇至3.50 mL，配成一系列浓度梯度的芦丁对照品溶液，即浓度为0.00 g·L-1、0.02 g·L-1、0.03 g·L-1、0.04 g·L-1、0.05 g·L-1、0.06 g·L-1、0.05 g·L-1，分别加入5%NaNO20.5 mL，摇匀，静置 6 min；加10%Al(NO3)30.5 mL，摇匀，静置 6 min；最后加4%NaOH 5 mL，摇匀，用水定容，避光放置 12 min，以零管为空白，在510 nm处测定吸光度值，以吸光度值(A)为纵坐标，对照品浓度(C)为横坐标绘制标准曲线，见图1。得线性回归方程为：y=13.114x+0.002 5，r=0.999 8(n=6)，结果表明芦丁在浓度0.02～0.07 g·L-1范围内线性关系良好。金钟花总黄酮含量根据标准曲线回归方程计算。

金钟花总黄酮得率的计算公式：

总黄酮得率(mg·g-1)=(C×稀释倍数×V)/m

式中：C表示供试品溶液稀释后在510 nm处测得的吸光度值，代入线性回归方程得到的黄酮浓度；V表示供试品溶液的体积；m表示样品质量。

图1 芦丁标准曲线

1.2.2 单因素实验设计精密称取0.1 g金钟花粉末，以芦丁的得率为指标，研究乙醇浓度(40%，60%，70%，80%，90%和100%)、料液比(gmL) (120，140，150，160，170和180)和提取时间(5 min，15 min，20 min，25 min和30 min)对金钟花总黄酮得率的影响。

1.2.3 因素和水平设计以单因素实验结果为基础，选择对金钟花总黄酮得率有影响的3个因素，采用响应面法中的Design-Expert 11软件进行优化设计实验。以乙醇浓度(A)、料液比(B)和提取时间(C)为自变量，总黄酮得率为响应值进行实验设计，因素水平及设计见表1。

表1 实验因素及水平设计表

1.2.4 金钟花总黄酮成分抗DPPH自由基清除率检测实验以清除DPPH自由基能力[18]作为测定金钟花总黄酮抗氧化能力的指标，本实验以Vc、芦丁为对照，精密配制0.01 g·L-1DPPH溶液，0.102 1 g·L-1Vc溶液，0.200 0 g·L-1芦丁对照品溶液，金钟花样品溶液浓度为0.01 g·mL-1；分别将金钟花总黄酮提取液、芦丁和Vc稀释为不同浓度待测液。样品组(A1)：100 μL供试品溶液+100 μL DPPH 溶液；对照组(A0)：100 μL供试品溶液+100 μL无水乙醇；空白组(A2)：100 μL无水乙醇+100 μL DPPH溶液。避光放置30 min，在酶标仪517 nm波长处测定吸光度值。不同浓度待测液和空白均平行3次，取平均值，计算DPPH清除率及半数抑制浓度IC50。注：DPPH和Vc现用现配，避光保存。

DPPH清除率=[1-(A1-A0)/A2]×100%

2 结果

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对金钟花总黄酮得率的影响由图2可知，在30 ℃，超声功率为120 W、料液比 1 g30 mL、提取时间30 min的条件下，随着乙醇浓度的增加，在90%乙醇浓度下总黄酮得率较高，根据相似相溶原理，乙醇浓度越大，溶剂极性越小，黄酮类物质极性偏低，此时原料总黄酮化合物容易析出，因此，选取90%乙醇作为总黄酮提取溶液。

图2 乙醇浓度对金钟花总黄酮得率的影响

2.1.2 料液比对金钟花总黄酮得率的影响由图3可知，在30 ℃，超声功率120 W，90%乙醇(由2.1.1项可知)，提取时间30 min的条件下，随着料液比的不断增大，总黄酮得率不断增加，但是增加趋势逐渐缓慢，由于原料的量一定，随着乙醇的量不断增加，总黄酮析出基本稳定不再增加。基于此，从节省溶剂的角度考虑，选择料液比1 g70 mL较为合适。

图3 料液比对金钟花总黄酮得率的影响

2.1.3 提取时间对金钟花总黄酮得率的影响由图4可知，在30 ℃、超声功率120 W、90%乙醇、液料比1 g70 mL(由2.1.2项可知)的条件下，提取时间20 min总黄酮得率最大，提取时间超过20 min后总黄酮得率逐渐减小，由于超声产生的空化作用，加速原料中细胞壁破裂，总黄酮溶出加快，但杂质也随之溶出，影响总黄酮得率下降。因此选择提取时间为20 min比较合适。

图4 提取时间对金钟花总黄酮得率的影响

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计与结果依照表1实验因素及水平表，以总黄酮得率为响应值，对3个实验因素进行响应面实验分析设计方案，其设计与结果见表2所示。

表2 Box-Behnken实验设计与结果

2.2.2 方差分析将表2实验数据通过Design-Expert 11软件进行计算，结果见表3所示。对3个因素进行回归拟合，得二次多项回归方程：

Y=-1 366.760 63+32.236 13×A+1.215 81×B-1.441 87×C-0.001 363×AB+0.033 275×AC-0.000 950×BC-0.182 875×A2-0.004 637×B2-0.040 950×C2(式中Y表示金钟花总黄酮得率)

由表3方差分析可知，F=27.84，P=0.000 1<0.01，表明该模型极显著，说明本次建模有意义；失拟项F=1.76，P=0.292 9>0.05，不显著，说明实验误差较小。模型系数R2=0.972 8，校正系数R2adj=0.937 9，说明模型拟合度较好，具有统计学意义，可用该方程进行数据分析和预测；模型变异系数CV=2.72%，显示实验统计数据可靠，能很好地预测响应面。表3各项方差中，一次项B极显著(P<0.01)，A、C不显著(P>0.05)；二次项A2极显著(P<0.01)，C2显著(P<0.05)，B2不显著(P>0.05)；交互项BC、AB(F<0.05)，AC(F>0.05)。通过对ABC三项的F值比较，影响金钟花总黄酮得率的各因素先后顺序为：A>C>B，即乙醇浓度>提取时间>液料比。

表3 方差分析

2.2.3 响应面和等高线图参考文献[19]，通过Design-Expert 11软件分析得到如下两因素各个交互的三维图(图5-图7)。两因素交互项的三维图越陡峭，等高线呈椭圆则表明这两因素的交互项对响应值的影响越显著。反之，等高线近似圆形，则说明两要素交互作用不明显，相互影响较小。图中三维图的陡峭顺序：AC>AB>BC，这与模型的方差分析相一致。

图5 乙醇浓度、液料比对总黄酮提取率影响响应面图

图6 提取时间、乙醇浓度对总黄酮提取率影响响应面图

图7 提取时间、液料比对总黄酮提取率影响响应面图

2.3 验证实验采用Design-expert 11软件分析得到3个单因素的最佳预测结果：乙醇浓度为90%，料液比为1 g：88 mL，超声时间为20 min，此时，响应值总黄酮提取率为105.726 mg·g-1。按照预测的最佳结论进行实验，数据与结果见表4。

表4 实验结果

平行精密称取5份金钟花粉末，按照最佳实验条件进行实验，计算总黄酮得率，由表4可知，RSD为3.26%，说明重复性较好，可行性高，参数可靠稳定。从表4可以看出，对于金钟花中总黄酮的工艺优化，实测值与真实值绝对误差最小值和最大值为0.10 mg·g-1、8.60 mg·g-1，相对误差最小值和最大值分别为0.09%、8.13%，平均绝对误差为 4.59 mg·g-1，平均相对误差为4.34%。根据RSD和相对误差可以说明，此方法对金钟花中总黄酮的提取预测较为准确，为后期黄酮的提取开发研究提供参考。

2.4 金钟花抗DPPH自由基结果参考文献[20]，以提取液浓度为横坐标，金钟花样品液、Vc、芦丁对DPPH自由基的清除率(%)为纵坐标绘制线性关系图(见图8)，并得出其线性方程计算IC50。由图8可知，在一定浓度范围内，样品液、Vc、芦丁对DPPH自由基的清除率均随浓度增大呈近似线性关系。金钟花：y=35.133x+0.111 7，IC50=11.05 mg·L-1；芦丁：y=24.861x+0.064 3，IC50=17.53 mg·L-1；Vc：y=110.83x+0.139，IC50=3.26 mg·L-1；清除 DPPH 自由基的大小顺序为VC>金钟花总黄酮提取液>芦丁。说明金钟花具有较强的抗氧化活性。

图8 自由基清除力比较

3 讨论

在预实验中，由于金钟花粉碎粒度过细(80目)，以无水乙醇为提取溶液，发现提取1遍和2遍金钟花总黄酮得率相差很小，因此，为消除误差，选择提取1遍，平行2份，取平均值。

本实验在单因素和响应面实验的基础上，优化金钟花总黄酮提取工艺，确定最佳提取工艺为：乙醇浓度90%，料液比1 g88 mL，超声时间20 min，在此条件下金钟花中总黄酮的得率为101.17 mg·g-1，优化得到的工艺合理可行。以芦丁和Vc作对照，通过对清除DPPH自由基能力测定[21]，评价金钟花总黄酮抗氧化活性大小，其中VcIC50=3.26 mg·L-1、金钟花总黄酮IC50=11.05 mg·L-1和芦丁IC50=17.53 mg·L-1，清除DPPH自由基能力的大小顺序为Vc>金钟花总黄酮提取液>芦丁。金钟花具有较高的抗氧化活性，且其体外抗氧化能力在一定范围内随着总黄酮质量浓度的增加而增加，可以作为天然抗氧化剂原料。