基于网络药理学和分子对接技术探讨四妙消痹汤治疗类风湿关节炎的作用机制*

许博，马俊福，郑福增，赵晶晶

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046； 2.河南省中医院，河南 郑州 450000

类风湿关节炎是以患者关节活动受限和畸形为主要症状的自身免疫性疾病，在中医学中属“尪痹”范畴。目前，治疗类风湿关节炎的常用药物分为四大类，即非甾体类抗炎药(nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)、改善病情的抗风湿药(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)、糖皮质激素和植物药[1]。但这些常用治疗药物大多存在不良反应且需要长期服用以维持疗效，给患者生活带来较大困扰。

四妙消痹汤由金银花、玄参、当归、甘草、白花蛇舌草、山慈菇、豨莶草、虎杖、白芍、土茯苓和威灵仙组成，方中金银花清热解毒、疏散风热，具有抗炎、免疫调节的作用[2]；玄参滋阴、降火、生津、凉血、解毒，具有抗炎、抗菌功效[3]；当归补血活血、调经止痛，具有抗炎镇痛、抗氧化作用[4]；甘草补脾益气、缓急止痛、缓和药性、调和诸药，具有抑菌、抗肿瘤的作用[5]；白花蛇舌草清热解毒、利尿消肿、活血止痛，具有抗菌消炎、抗肿瘤作用[6]；山慈菇清热解毒、化痰散结[7]；豨莶草祛风湿、通络利筋骨、益肝肾[8]；虎杖清热解毒、利湿退黄、散瘀止痛、化痰止咳[9]；白芍平肝止痛、养血调经、敛阴止汗[10]；土茯苓祛风湿、利关节、解毒、镇痛、抗菌[11]；威灵仙祛风湿，通经络，止痛，消骨鲠[12]，诸药共用，起到利湿通痹、柔筋利节、清热解毒、活血止痛的功效。

四妙消痹汤在临床常被用来治疗类风湿关节炎，但其作用机理鲜有研究，本研究基于网络药理学进行讨论分析，旨在探索四妙消痹汤治疗类风湿关节炎的具体作用机制，为后续药物治疗提供思路。

1 资料与方法

1.1 四妙消痹汤组方中药活性成分及其作用靶点筛选通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/)进行检索并以化合物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为标准筛选获得四妙消痹汤中11味中药的有效成分及其相关靶点，再通过uniprot数据库对药物有效成分相关靶点进行名称规范，并获得其简称。

1.2 类风湿关节炎疾病靶点及四妙消痹汤治疗类风湿关节炎潜在靶点的获取通过GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)、在线人类孟德尔遗传(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//www.omim.org/)数据库、药物基因组学知识库(pharmacogenomics knowledgebase，PharmGKB，https：//www.pharmgkb.org/)、药物靶标数据库(therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank数据库(https：//go.drugbank.com/)搜索类风湿关节炎相关疾病靶点，将5个数据库获得的靶点信息导入R语言，排除重复靶点。利用R语言将药物有效成分相关靶点与类风湿关节炎相关靶点进行映射，得到的重复靶点即为四妙消痹汤治疗类风湿关节炎的潜在靶点，并据此绘制Venn图。

1.3 蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络将四妙消痹汤治疗类风湿关节炎的潜在靶点导入STRING(https：//cn.string-db.org/)在线分析平台，蛋白种类种属设置为“Homo sapiens”并设置最低相互作用阈值>0.95，其他设置保持默认，获得PPI网络。利用Cytoscape软件中的CytoNCA插件对PPI网络进行拓扑分析，筛选得到核心靶点。

1.4 基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路富集分析利用R语言和BiocManager中的数据包将四妙消痹汤治疗类风湿关节炎的潜在靶点转换为基因ID。再使用R软件中的数据包和相关函数进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析，并将富集分析结果中前20条进行可视化。

1.5 分子对接根据PPI网络拓扑分析结果，结合文献查阅，选取3个核心靶点及3个药物有效成分进行分子对接。在PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中搜索药物有效成分2D结构，再利用ChemBio3D Ultra 14.0软件转化为3D结构；通过PDB(RCSB PDB：Homepage https：//www.rcsb.org/)数据库下载核心靶点的蛋白结构并利用PyMOLWin软件对蛋白结构进行简化。将药物有效成分3D结构和核心靶点蛋白结构数据导入AutoDockTools-1.5.6软件得到活性口袋数据，通过R语言运用Vine进行分子对接并利用PyMOLWin.exe软件进行可视化。

2 结果

2.1 四妙消痹汤组方中药活性成分及其作用靶点筛选通过TCMSP检索获得四妙消痹汤中11味中药的有效成分190个，其中白花蛇舌草7个、白芍13个、当归2个、甘草92个、虎杖10个、金银花23个、山慈菇3个、土茯苓15个、威灵仙7个、豨莶草9个、玄参9个。通过TCMSP检索190个有效成分的相关靶点，去重后共得到215个。

2.2 四妙消痹汤治疗类风湿关节炎的潜在作用靶点通过GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD及DrugBank数据库搜索类风湿关节炎相关疾病靶点，删除重复靶点后共得到2 971个类风湿关节炎相关靶点，如图1。利用R语言将药物有效成分相关靶点与类风湿关节炎相关靶点进行映射，得到重复靶点151个，即为四妙消痹汤治疗类风湿关节炎的潜在靶点，如图2。

图1 类风湿关节炎相关靶点信息

图2 四妙消痹汤与类风湿关节炎共同靶点

2.3 PPI网络将四妙消痹汤治疗类风湿关节炎的潜在靶点导入STRING在线分析平台，得到PPI网络，如图3。同样将数据导入Cytoscape3.8.0得到图4A。利用Cytoscape3.8.0中的CytoNCA插件进行拓扑分析，依据Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC、Network 6个参数的中位值为标准，筛选得到关键靶点，见图4B。以相同的标准对关键靶点进行再次筛选后得到核心靶点基因11种，包括JUN、MAPK1、FOS、TP53、ESR1等，图4C。

图3 PPI网络

注：A：PPI网络；B：关键靶点PPI网络；C：核心靶点PPI网络图4 核心靶点PPI网络

2.4 GO功能富集分析与KEGG信号通路富集分析采用R语言对四妙消痹汤治疗类风湿关节炎的潜在靶点进行GO功能富集分析，其中包括生物学过程、分子功能和细胞组分。生物学过程主要包括对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、对细菌来源分子的反应(response to molecule of bacterial origin)、细胞对化学应激的反应(cellular response to chemical stress)、对金属离子的反应(response to metal ion)、对氧化应激的反应(response to oxidative stress)等；细胞组分主要包括膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、转录调节复合物(transcription regulator complex)、转移酶复合物(transferase complex)、蛋白激酶复合物(protein kinase complex)等；分子功能包括DNA-结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)等，如图5。采用R语言对四妙消痹汤治疗类风湿关节炎的潜在靶点进行KEGG信号通路富集分析，根据P<0.05，筛选出172条信号通路，主要为脂质和动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、晚期糖基化终末产物(advanced glycation end product，AGE)-AGE受体(the receptor of AGE，RAGE)信号通路在糖尿病并发症中的作用(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型肝炎(hepatitis B)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)等，如图6。

图5 GO富集分析气泡图

图6 KEGG富集分析气泡图

2.5 分子对接结果根据PPI网络拓扑分析及相关文献，选取HSP90AA1、JUN及RELA 3个核心靶点与山柰酚(kaempferol)、毛地黄黄酮(luteolin)及槲皮素(quercetin)3个药物有效成分进行分子对接发现，药物有效成分与核心靶点之间能相互结合并有较好的亲和力。见图7、表1。

注：A：HSP90AA1与kaempferol；B：HSP90AA1与luteolin；C：HSP90AA1与quercetin；D：JUN与kaempferol；E：JUN与luteolin；F：JUN与quercetin；G：RELA与kaempferol；H：RELA与luteolin；I：RELA与quercetin图7 药物有效成分与核心靶点分子对接示意图

表1 药物有效成分与核心靶点分子对接结果 (kcal·mol-1)

3 讨论

类风湿关节炎是一种常见慢性疾病，其活动期症状往往表现为关节疼痛、肿胀变形，严重者会导致关节畸形和功能丧失，多见于中年女性[13]。《千金要方》中提到“热毒流于四肢，历节肿痛”，据此采用清热解毒、通痹止痛的治疗方法，四妙消痹汤具有清热解毒、活血止痛、通痹利湿的功效，因此，临床上常采用四妙消痹汤治疗活动期类风湿关节炎，具有较好的疗效[14]，且不良反应较少，具有较高的临床价值[15]。

本研究利用网络药理学对四妙消痹汤治疗类风湿关节炎的药理学机制进行研究，筛选出四妙消痹汤主要活性成分为豆甾醇、槲皮素、山柰酚、甘草宁B、β-谷甾醇、芍药苷、儿茶素、华良姜素、异鼠李素、木樨草素等。研究表明，豆甾醇可通过刺激网状内皮系统增生，加强巨噬细胞能力，从而发挥抗炎作用[16]。槲皮素可有效抑制分泌多种致炎分子的环氧合酶-2(cyclooxygenase 2，COX-2)促进子的转录活性，同时能够刺激细胞增殖[17]，还能通过降低中性粒细胞对炎症因子的敏感性从而达到抗炎的作用[18]。山柰酚可以通过抑制炎症因子一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、COX-2及C-反应蛋白 (C-reaction protein，CRP)等的表达发挥抗炎作用[19]，且高剂量山柰酚还可通过调节钙离子代谢平衡，促进骨胶原生成[20]。研究表明，山柰酚可通过抑制黄嘌呤氧化酶活性减少体内黄嘌呤生成尿酸，从而降低高尿酸血症和痛风[21]，还可通过降低氧化低密度脂蛋白诱导的B类清道夫受体CD36mRNA表达保护低密度脂蛋白的氧化，通过抑制巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄取防止动脉粥样硬化的发生[22]。刘慧琼等[23]通过对猪油的抗氧化实验发现，β-谷甾醇是一种良好的抗氧化剂，具有很好的清除自由基的能力，由于自由基与衰老、炎症、休克、动脉粥样硬化、药物及酒精中毒等有关，β-谷甾醇还可作为外源性氧自由基清除剂。芍药苷可通过调节糖原合成酶激酶3β和核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信号通路降低β-淀粉样蛋白诱导的胶质细胞和星形胶质细胞活性从而达到下调促炎因子表达和上调抗炎因子表达的效果[24]。曾亮等[25]通过抑菌环实验证明了儿茶素对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有抑制作用。研究表明，木樨素通过抑制DNA拓扑异构酶活性影响菌体核酸和蛋白质合成，具有明显的抑菌活性，且在0.30～9.75 mg·L-1浓度范围内可明显抑制柯萨奇B3病毒引起的细胞病变，具有体外抗柯萨奇B3病毒的作用[26-27]。此外，木樨草的抗炎作用可能与其抑制核内NF-κB的表达和降低DNA结合活性从而下调COX-2蛋白的表达有关[28]。

PPI网络拓扑分析可知，四妙消痹汤治疗类风湿关节炎主要靶点为CCND1、FOS、MAPK3、ESR1、JUN。研究发现，宫颈癌癌变组织中CCND1呈高表达，具有促癌作用，沉默CCND1基因表达可抑制宫颈癌的发生发展并提高化疗敏感性[29]。鲍亮等[30]研究发现，ESR1基因多态性与膝骨关节炎发病有一定联系，ESR1基因突变可能会增加膝骨关节炎患病风险。核心靶点GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析发现，四妙消痹汤治疗类风湿关节炎主要涉及的通路有脂质和动脉粥样硬化、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、IL-17信号通路、TNF信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等。大量实验和临床证据表明，在自身免疫性疾病和炎性病变中都有 IL-17 的参与，且在诱导自身免疫反应和炎症病变的过程中IL-17起到了重要的调节因子的作用[31]。姜瑞雪等[32]研究发现，固本健脑方改善老年健忘大鼠记忆功能的分子机制与AGE-RAGE信号通路密切相关。JUN家族成员包含c-JUN、JUNB和JUND[33]，研究发现，植物乳杆菌NCU116通过c-JUN信号通路促进结肠黏膜稳态和Muc2基因表达[34]。在分子对接中，一般认为配体与受体分子的构象稳定时，其能量越低，发生作用的可能性越大，因此根据分子对接结果显示山柰酚、毛地黄黄酮、槲皮素与JUN结合度最好，山柰酚是一种天然的免疫抑制剂，可减少由于T淋巴细胞过度活化和增殖所导致的自身免疫病和器官移植排斥反应的发生，毛地黄黄酮(木樨草素)能通过降低炎症因子转录调节因子的活性减少促炎细胞因子和炎症介质的产生[35]，槲皮素能够通过降低中性粒细胞对炎症因子的敏感性达到抗炎效果[18]，JUN(c-JUN)通过调节肿瘤抑制因子PTEN的表达促进细胞生存[36]。

综上所述，四妙消痹汤治疗类风湿关节炎具有多成分、多靶点、多途径的特点，为临床应用治疗提供了科学依据，也为探索新的治疗方法提供思路。