青藤碱对肾癌细胞786-O细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响

谢程国 马胜利 张镜伟

广州市第一人民医院泌尿外科(广州 511458)

青藤碱(C19H23NO4)是一种生物碱单体，从青藤干燥的根和茎中提取[1]。多项研究发现青藤碱在细胞增殖、凋亡、转移和血管生成等多种生物学过程中发挥着重要作用[2- 5]。而且，越来越多的研究表明青藤碱具有抗肿瘤作用，例如体外实验表明青藤碱能抑制肺癌细胞NCI-H460和白血病细胞的的增殖，促进细胞凋亡，并增加肿瘤细胞对化疗的敏感性[6- 7]，同时也有抗前列腺癌作用[8]。此外，青藤碱还能减少乳腺癌细胞的迁移和侵袭。这些结果阐明了青藤碱在不同肿瘤中的抗肿瘤作用。但是迄今为止，青藤碱在肾癌细胞中的作用还没有报道。因此，在本文中我们拟探讨青藤碱对人肾癌细胞786-O细胞增殖、细胞周期分部及凋亡的影响，以期为防治肾癌提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)扩增和反转录试剂盒均购买于日本Takara公司；四氮唑蓝盐(May-Thumer syndrome，MTS)细胞繁殖定量检测试剂盒购置于美国Promega公司；主要使用的抗体包括c-myc(ab32072，Abcam，美国)， Bax(ab32503，Abcam，美国)，Caspase 3(ab32351，Abcam，美国)，GAPDH (ab8245，Abcam，美国)。青藤碱购于上海蓝木化工有限公司(Selleck，S2359)，于DMSO中溶解使其终浓度分别达到100 μM、150 μM、200 μM、250 μM。

1.2 细胞培养

人肾癌细胞株786-O和正常肾小管细胞HK- 2购于中国科学院干细胞库，HK- 2细胞在Keratinocyte Serum Free Medium (K-SFM)+1%青霉素和链霉素中培养；786-O在含有10%胎牛血清(Gbico)+1%青霉素和链霉素组合的RPMI1640 (Gbico)中培养。所有细胞在37 ℃标准细胞培养条件下(5% CO2, 95%湿度)生长。

1.3 实时荧光定量PCR

取对数生长期细胞，采用Trizol提取786-O细胞总RNA，通过核酸蛋白定量仪(NanoDrop 2000)测定所提取RNA的浓度及纯度；然后，参照Takara公司的PrimescriptRTReagent Kit试剂盒说明书，将总RNA(1 μg)逆转录成cDNA；按照PrimeScriptTMRT Master Mix ( Perfect Real Time )试剂盒说明书，以反转录的cDNA为模版进行PCR反应，所需引物序列如表1所示：

表1 各基因引物序列

记录各组CT值并采用公式2-ΔΔCT对数据进行处理分析，得到各个细胞株中基因的相对表达量。

1.4 蛋白免疫印迹(Western blot，WB)法

收集对数生长期786-O细胞，加入1×Cell Lysis Buffer裂解细胞，经超声、离心后去掉其他细胞成分，使用BCA蛋白定量分析试剂盒对提取的蛋白进行定量；加入5×SDS加样缓冲液，煮沸10 min 以使蛋白变性；配液10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，然后转膜，封闭，并在4 ℃与一抗孵育过夜；二抗室温孵育2小时，采用化学发光法检测目的蛋白表达，并进行灰度值分析。

1.5 MTS细胞增殖实验

按照MTS细胞繁殖定量检测试剂盒实验步骤，将100 μL完全培养基中的2 000个细胞接种到96孔板中，在37 ℃和5% CO2下培养1～5天，然后每个时间点在培养基中加入10 μL MTS, 37 ℃下孵育4 h后, 490 nm波长下测定每孔吸光度，根据结果绘制细胞生长曲线。

1.6 流式细胞周期检测

通过流式细胞术检测不同浓度青藤碱对786-O细胞周期的分布。取对数生长期细胞，用PBS清洗3遍后加入不含血清FBS的1640培养基，然后使用预冷75%乙醇固定细胞，置于4 ℃过夜；第二日离心去除乙醇，经PBS清洗后，加入100 μL RNase A，于37 ℃水浴箱中放置30 min；然后加PI染液于4 ℃冰箱密封避光反应1小时；最后上机检测，根据细胞内各阶段DNA的含量来确定细胞周期的分布。

1.7 流式细胞凋亡检测

利用流式细胞仪检测细胞周期，取对数生长期细胞，胰酶消化，使用Annexin V凋亡检测试剂盒APC (Cat: 88- 8007, ebiosicence)，按照实验步骤双染APC偶联Annexin V (annexin V-APC)和碘化丙啶(PI)，使用FACSCalibur (BD Bioscience)对细胞进行分析。每个样本共采集20000个细胞，使用BD CellQuest软件对数据进行分析。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 不同浓度青藤碱对肾癌细胞786-O增殖能力的影响

为了探讨青藤碱在肾癌细胞中的生物学作用，我们在786-O细胞培养基中加入不同浓度的青藤碱(培养基中青藤碱终浓度分别为100、150、200、250 μmol/L)。如图1所示，与DMSO及空白组相比，不同浓度青藤碱均明显抑制786-O细胞的增殖能力，且随着浓度的增高，其抑制作用愈强，结果具有统计学意义(P< 0.05)。

2.2 青藤碱诱导786-O细胞周期G1/S期阻滞

我们进一步探讨青藤碱对细胞周期分布的影响。结果如图2所示，空白组和DMSO组细胞G1期细胞百分比分别占48.46%、46.76%，S期细胞百分比分别占34.74%、40.61%，而加入不同浓度青藤碱后，G1期细胞分别增加到52.10%(100 μmol)，56.93%(150 μmol)，57.60%(200 μmol)，59.32%(250 μmol)，而S期细胞减少至41.86%(100 μmol)，37.04%(150 μmol)，30.15%(200 μmol)，30.04%(250 μmol)，说明青藤碱可以诱导786-O细胞周期G1/S期阻滞。

2.3 青藤碱诱导786-O细胞凋亡

空白组和DMSO组晚期凋亡细胞百分比分别为0.38%、0.86%，而加入不同浓度青藤碱后，凋亡细胞百分比分别增加到2.98%(100 μmol)，3.71%(150 μmol)，4.72%(200 μmol)，6.77%(250 μmol)，说明青藤碱可以诱导786-O细胞凋亡(P<0.05)。见图3。

2.4 青藤碱对细胞周期及凋亡相关蛋白表达水平的影响

我们分别用DMSO、青藤碱(200 μmol)处理肾癌786-O细胞，qRT-PCR与WB分别检测细胞周期及凋亡相关蛋白的表达水平。结果如图4所示，青藤碱显著下调c-myc蛋白及mRNA水平，而诱导凋亡蛋白Bax、Caspase- 3表达上调(P<0.05)。

3 讨 论

近年来，肾细胞癌在全球的发病率逐年上升，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。据统计，2017年美国肾细胞癌新发病例63 990例，死亡病例14 400例，发病率约占成人恶性肿瘤的5%[9]。肾小管癌起源于肾近端小管细胞，透明细胞癌是最常见的亚型，占转移性肾小管癌的80%～85%[10]。在治疗方面，肾细胞癌对放疗和化疗不敏感。虽然手术切除肿瘤是目前的最佳治疗策略，但其术后复发率为20%～40%[11]。而且由于肾小细胞癌对放化疗有抵抗性，因此缺乏有效的术后辅助治疗[12]。此外，缺乏早期诊断肾细胞癌的生化标志物和随访资料，阻碍了肾细胞癌的及时诊断。近些年靶向药物的应用为肾癌的治疗提供了新的解决途径。然而不幸的是，随着靶向药物应用时间的延长，患者均会对靶向药物产生耐药，加大靶向药物的剂量则会产生严重的不良反应，严重影响了靶向药物的临床疗效。因此，我们急需发现新的治疗药物和靶点，以期改善晚期肾癌患者的生存质量及生存时间。

目前，大量证据表明，许多中草药提取物具有很强的抗癌能力，如穿心莲内酯[13]、魔芋[14]等。青藤碱是从中草药青藤中提炼出来的一种异喹啉类生物活性碱。青藤碱对类风湿性关节炎的临床治疗有显著的疗效已被广泛报道[15- 16]。在癌症治疗中，青藤碱对肿瘤的抑制作用也已在多种肿瘤中被发现，它通过介导细胞增殖和凋亡来发挥作用[17]，如青藤碱抑制卵巢癌[18]细胞生长能力，降低c-myc和Cyclin D1蛋白水平。青藤碱有极小的毒副作用，因此近年来青藤碱在抗肿瘤中的应用越来越受到科研工作者们的重视。在本研究中我们发现，青藤碱可抑制786-O细胞增殖，诱导细胞周期G1/S期阻滞，促进细胞凋亡。青藤碱下调786-O细胞中c-myc的表达水平，而诱导凋亡相关蛋白Bax和Caspase 3表达上调。这些结果说明，青藤碱在肾癌细胞中发挥抗肿瘤作用。

到目前为止，已有许多文献报道了青藤碱抗肿瘤的能力。研究表明，5-氟尿嘧啶与青藤碱具有显著的协同作用，与5-氟尿嘧啶相比，可以抑制LoVo细胞的生长[19]。其他一些报告表明，青藤碱处理的A549与未处理的细胞相比，细胞数量减少。有研究者也指出青藤碱触发时间依赖性的细胞毒性，导致NCIH460的显著损失细胞生存能力[20]。我们的研究也得出了类似的结论，与对照组相比，青藤碱处理后786-O细胞的抑制率明显降低，且抑制率随青藤碱浓度的增加而增加。青藤碱显著下调c-myc蛋白表达，而诱导凋亡蛋白Bax、Caspase- 3表达上调。以上结果表明，青藤碱通过诱导786-O细胞周期G1/S期阻滞，促进凋亡来提高对肾细胞癌的抑制作用。