基于谱-效相关分析的西红花抗抑郁药效成分的研究

李 萌，章从恩，章 前，于卫东，陈 熹，马致洁#，赵奎君#

(1.首都医科大学附属北京友谊医院中药剂科，北京 100050；2.北京科园信海医药经营有限公司，北京 100160；3.上海市药材公司，上海 200002)

鸢尾科植物番红花CrocussativusL.原产于地中海地区，现已种植在阿富汗、希腊、西班牙和印度等地[1]。我国于1965年开始引种试验，现已成功在上海、云南、浙江、江苏和新疆等地培育成功[1-2]。西红花为其干燥柱头，具有活血化瘀、凉血解毒和解郁安神之功效[3-4]。在现代医学中，大量的科学研究考察了西红花治疗或预防精神疾病、心血管疾病、神经退行性疾病和恶性肿瘤等的可能功效[5-7]。其中，西红花已被大量研究结果证实具有抗抑郁的作用，成为一种很有前途的治疗抑郁症的中药[8-11]。前期研究结果发现，不同产地西红花药材中主要成分含量差异较大[1]。这些差异是否会造成其药效学的不同，具体哪些成分在其抗抑郁中起主要贡献作用，尚不明确。为了明确成分与生物效应的关系，本研究首先比较了不同产地西红花药材抗抑郁效应的差异，进一步采用多元统计分析，将化学成分与其生物效应进行多元线性回归分析，寻找与其抗抑郁作用药效学相关的主要化学成分，为其抗抑郁作用研究提供科学参考[12-14]。

1 材料

1.1 仪器

HPLC-IT-TOF/MS液相色谱串联离子阱飞行时间质谱(LC-MS)、Inertsil ODS-SP C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)均购自日本岛津公司；Centrifuge 5424R小型冷冻高速离心机、Research Plus单道手动型微量移液器均购自德国Eppendorf公司；NV-425-400s Labgard生物安全柜、NV-5510E CO2细胞培养箱均购自美国Nuaire公司；KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XS205型电子分析天平[梅特勒-托利多科技(中国)有限公司]；BSA224S-CW电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；Leica DMi1倒置生物显微镜(德国Leica公司)；96孔细胞培养板(美国Corning公司)；SpectraMax M3酶标仪(美国Molecular Device公司)；TC20细胞计数仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 药品与试剂

实验所用西红花药材均由上海药材有限公司提供(产地信息见表1)，经首都医科大学附属北京友谊医院赵奎君教授鉴定为鸢尾科植物番红花CrocussativusL.的干燥柱头。RPMI Medium 1640 basic(1×)培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(FBS，美国HyClone公司)；100×青霉素-链霉素溶液(P/S，北京兰杰柯科技有限公司)；磷酸缓冲盐溶液(PBS，北京索莱宝科技有限公司)；0.25%Trypsin-EDTA(美国Gibco公司)；CCK-8试剂盒(日本Dojindo Lab公司)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)；皮质酮(CORT，美国Sigma公司)。

表1 西红花药材的产地信息Tab 1 Origin information of saffron

2 方法

2.1 药材样品制备

2.1.1 液相样品制备：精密称定10个不同产地西红花药材粉末各100 mg，分别置于50 mL棕色具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇溶液20 mL，称量质量，置于冰水中超声处理30 min(功率为150 W，频率为40 Hz)，取出，再次称量质量，用75%乙醇溶液补足减少的质量，混匀，过滤，4 ℃储存备用[11]。

2.1.2 细胞实验样品制备：称量10个不同产地西红花药材样品各100 mg，粉碎后加入75%乙醇溶液20 mL于冰水中超声提取30 min(功率为150 W，频率为40 Hz)，过滤，冷冻干燥，得提取物(避光操作)。将西红花提取物溶于水中，配置成0.2 mg/mL储备液(按照生药材计算)，用0.22 μm的微孔滤器除菌，4 ℃储存备用[11]。

2.2 色谱及质谱条件

2.2.1 色谱条件：Inertsil ODS-SP C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(5%甲醇/95%水-95%甲醇/5%水)，梯度洗脱(0～5 min，5%B；5～10 min，10%B；10～20 min，25%B；20～25 min，50%B；25～30 min，80%B；30～35 min，95%B)；流速为1 mL/min；检测波长为254 nm；柱温为40 ℃；进样量为10 μL。

2.2.2 质谱条件：电喷雾化离子源，负离子检测(离子源温度为120 ℃)；毛细管电压为3 200 V，质量扫描范围m/z为100～1 000；干燥气体积流量为10 L/min；干燥气温度为300 ℃。

2.3 细胞系及培养条件

PC12细胞(购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所)在含有5%CO2、温度为37 ℃的恒温培养箱中培养。完全培养基：RPMI 1640培养基+10%FBS+1%P/S。4 ℃储存备用。

2.4 细胞实验方法及西红花药效检测

取对数生长期PC12细胞，以2×104个/孔细胞向96孔细胞培养板接种，培养24 h后，按照以下方式分组：(1)正常对照组(NC)：含1%胎牛血清培养基培养，不做其他处理；(2)CORT损伤模型组：以CORT 500 μmol/L 处理；(3)西红花给药组：含1%胎牛血清培养基稀释西红花储备液至5 μg/mL，均预给药24 h，之后加入CORT 500 μmol/L 处理24 h，结束后采用CCK-8法检测细胞存活率[11]。

2.5 数据统计分析

3 结果

3.1 指纹图谱建立

本研究在课题组前期研究结果上，按照上述样品制备方法和液相质谱条件，建立10个不同产地西红花药材化学指纹图谱，见图1。并从质谱离子流图谱信息中初步指认西红花药材的主要成分，见表2—3[15-16]。

图1 10批样品HPLC指纹图谱Fig 1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

表2 西红花药材的化学成分鉴定(ESI+)Tab 2 Identification of chemical components of saffron(ESI+)

表3 西红花药材的化学成分鉴定(ESI-)Tab 3 Identification of chemical components of saffron (ESI-)

3.2 不同产地西红花药效检测结果

采用不同产地相同浓度西红花预处理PC12细胞24 h后，加入CORT 500 μmol/L作用24 h，细胞存活率均较模型组有所提高，见表4。

表4 细胞存活率

3.3 西红花主要成分与抗抑郁效应的简单相关及多元回归分析

3.3.1 西红花主要共有峰面积与药效的简单相关分析：为了独立考察各成分与药效之间的相关性，以各产地西红花药效为因变量Y，以西红花样品中主要的11个共有峰面积为自变量x1—x11，分别采用SPSS软件单独进行简单相关分析[17-18]。结果显示，西红花的几个主要成分的相对峰面积与药效指标存在一定的正相关性，x8与Y的简单相关系数为0.860(P=0.001<0.01)，提示西红花苷-Ⅰ相对含量与西红花对PC12细胞的保护作用药效具有较强的正相关性；x9与Y的简单相关系数为0.715(P=0.020<0.05)，提示西红花苷-Ⅱ相对含量与西红花对PC12细胞的保护作用药效具有一定的正相关性；x11与Y的简单相关系数为0.572(P=0.048<0.05)，提示藏花醛相对含量与西红花对PC12细胞的保护作用药效具有一定的正相关性，见表5。

表5 西红花主要成分与抗抑郁效应的简单相关分析结果Tab 5 Simple correlation analysis between main components of saffron and antidepressant effects

3.3.2 多元相关分析：采用SAS 9.2(SAS Inc.,USA)软件进行多元回归的方法探讨西红花对PC12细胞的保护作用药效与成分之间的相关性[19-21]。回归模型中，以各产地西红花药效为因变量Y，以西红花各产地样品中的11个共有峰面积为自变量x1—x11，因自变量较多，故首先进行了共线性诊断，结果表明回归模型存在较严重的共线性，因此，本研究采用主成分回归分析探讨西红花药效学与成分之间的相关性[20-21]。通过SAS 9.2软件进一步分析，得到了回归矩阵中各主成分的特征值及贡献率，见表6。由表6可知，变量Z1、Z2和Z3累计贡献率>0.85，剔除其他主成分，选择Z1、Z2和Z33个主成分完成回归模型的建立。将主成分Z1、Z2和Z3的系数代入回归模型中，得到因变量Y与标准化后的自变量X1—X11的线性回归模型，再按照标准化公式X=(x-Mean)/STD，将标准化后的变量转换为原始自变量，得到因变量Y1与原始变量x1—x11的线性回归方程[20-21]。公式为Y=0.377 7+(1.796 5x1-5.691 7x2+1.912 5x3-4.948 7x4+6.298 3x5-5.481 2x6-7.123 9x7+20.428 1x8+17.734 9x9-3.892 4x10+9.929x11)×10-9。上述主成分回归分析结果显示，拟合的回归模型中，R2=0.962 1，具有统计学意义(P=0.002 5<0.05)。由回归模型公式可知，变量x8、x9和x11(西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和藏花醛)具有较大的参数值，说明西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和藏花醛可能对西红花对PC12细胞的保护作用药效有较大的贡献度。

表6 主成分回归分析结果Tab 6 Results of principal component regression analysis

4 讨论

本研究通过对比10个不同产地西红花药材对细胞活力的影响，发现不同产地西红花药材之间的药效存在差异。通过药效学结果与11个共有峰相对峰面积的简单相关分析，发现西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和藏花醛与药效学均有一定正相关性，以相关系数R>0.80为指标，可初步确定西红花苷-Ⅰ可能是西红花抗抑郁作用相关性较强的成分；通过药效学结果与11个共有峰相对峰面积的主成分回归分析，发现拟合的回归的模型中，R2=0.962 1，且有统计学意义(P=0.002 5<0.05)。由回归模型可知，变量x8、x9和x11(西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和藏花醛)具有较大的参数值，说明西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和藏花醛可能对西红花的抗抑郁作用药效有较大的贡献度。综合简单相关分析与多元回归分析结果，初步认为西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和藏花醛可能与西红花对PC12细胞的保护作用具有较强的相关性，提示其在西红花抗抑郁作用上具有较大的贡献。

本研究为明确西红花抗抑郁成分，以及后续合理有效控制其质量、发挥其临床药用价值的研究提供了一定的数据支持。但也存在不足，为进一步验证该结果，课题组将于后续研究中购买或自制标准品，通过动物实验与生物实验相结合的方法，对实验结果进行进一步验证与更深入的探索。