穿心莲内酯对膜性肾病大鼠肾纤维化的影响及其机制研究Δ

周 靖，郭洋洋，陆春红，黄金杰，王 丹

(1.开滦总医院肾内科，河北 唐山 063000；2.廊坊市第四人民医院内二科，河北 廊坊 065700)

膜性肾病(membranous nephropathy，MN)为成人肾病综合征的常见病理类型，以肾小球基底膜增厚及上皮下免疫复合物弥漫性沉积为主要病理特征。MN约占原发性肾小球疾病的10%，其中约30%的患者可自行缓解，但约40%的患者在发病10年内发展为终末期肾病[1]。MN发病机制复杂，其中肾纤维化在MN疾病进展过程中发挥着重要作用[2-3]。穿心莲内酯是传统中药穿心莲的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒等多种药理作用[4-5]。有研究结果表明，穿心莲内酯对四氯化碳所致肝纤维化、博来霉素所致肺纤维化均具有明显的抑制作用[6-7]。但穿心莲内酯对MN的影响尚未见文献报道。本研究旨在探讨穿心莲内酯对MN大鼠肾纤维化的影响及相关机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康雄性SD大鼠80只，体重210～240 g，由河北医科大学实验动物学部提供[SCXK(冀)2018-004]，清洁环境(温度为23～25 ℃，湿度为55%～65%)饲养，自由饮水进食。实验方案经开滦总医院伦理委员会审查批准。

1.2 仪器

CL-8000型生化分析仪(日本Shimadzu公司)；UF-1000i型尿液分析仪(日本SYSMEX公司)；RT-6000型酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)；JEM1400 Flash型透射电镜(日本JEOL公司)；RM2245型石蜡切片机(德国Leica公司)；164-5050 型电泳仪(美国Bio-Rad公司)；DYCZ-40 D型转膜仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 药品与试剂

阳离子化牛血清白蛋白购自北京索莱宝生物科技有限公司(批号：SA8130)；弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司(批号：P6556)；穿心莲内酯购自广东万年青制药股份有限公司(批号：202005018)；盐酸贝那普利购自成都地奥制药集团有限公司(批号：201006)；肌酐(SCr)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号：200109)；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒、Masson染色试剂盒及增强型化学发光液(ECL)超敏发光试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(批号：G1120、G1340及SW2030)；肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)酶联免疫吸附试验检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号：200105、200413及200407)；Toll样受体4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)、转化生长因子-β1 (TGF-β1)、磷酸化Smad2、磷酸化Smad3、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、β-肌动蛋白(β-actin)和免疫球蛋白G二抗购自北京博奥森生物科技有限公司(货号：bs-20595R、bs-20355R、bs-0086R、bs-2224R、bs-23581R、bs-975R、bs-0837R、bs-0061R和bs-0295G)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组、模型制备与给药：(1)分组。适应性饲养1周后，将80只大鼠随机分为正常组、模型组、穿心莲内酯组(穿心莲内酯50 mg/kg)和贝那普利组(盐酸贝那普利10 mg/kg)，各20只。(2)造模。参照文献报道的方法，将20 mg阳离子化牛血清白蛋白溶于0.9%氯化钠溶液30 mL中，加入等量弗氏不完全佐剂并充分乳化，于双腋下和双腹股沟2日1次、共3次皮下注射乳化液1 mL，进行预免疫；尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白16 mg/kg进行正式免疫(2日1次、共15次)；通过尿蛋白试纸检测，结果为尿蛋白阳性即可判定造模成功[8-9]。(3)给药。穿心莲内酯组和贝那普利组大鼠分别连续4周灌胃给药，1日1次；正常组和模型组连续4周灌胃给予0.9%氯化钠溶液，1日1次。

1.4.2 肾功能指标水平检测：给药完成后，每组随机取10只大鼠，收集24 h尿液，通过磺基水杨酸法测定24 h尿蛋白定量；麻醉，经腹主动脉取血并离心取血清，然后按照试剂盒说明书依步进行处理，通过全自动生化分析仪测定SCr含量。

1.4.3 通过HE、Masson染色进行肾组织病理学检查：采血完成后，颈椎脱臼处死大鼠，在冰上取双侧肾组织，左侧肾脏置于4%甲醛溶液固定3 d、常规脱水和透明处理后，石蜡包埋、切片(厚度5 μm)，按照试剂盒说明书进行HE染色和Masson染色，然后通过光学显微镜观察肾组织病理学改变和纤维化状况(Masson染色图片中蓝色为胶原着色)。通过图像分析软件计算胶原容积分数(CVF)。

1.4.4 通过透射电子显微镜(TEM)观察肾组织超微结构变化：取右侧肾脏，经4 ℃、0.9%氯化钠溶液冲洗干净后置入浓度为3%的戊二醛溶液(pH=7.4)中固定3 d，以蔗糖缓冲液清洗、1%锇酸固定1 h、乙醇和丙酮混合液梯度脱水后进行包埋，60 nm厚度超薄切片后，经醋酸铀避光染色10 min、柠檬酸铅染色10 min后，通过TEM观察肾组织超微结构变化。

1.4.5 采用酶联免疫吸附试验检测肾组织TNF-α、IL-6和ICAM-1含量：取各组剩余的10只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，在冰上取双侧肾脏，左侧肾脏经剪碎、按1 ∶ 8的质量体积比加入4 ℃预冷裂解液、匀浆处理后，冰上静置1 h使其充分裂解，4 ℃离心(半径10 cm，转速3 500 r/min，时间10 min)取上清液，按照酶联免疫吸附试验试剂盒操作方法处理后，通过酶标仪检测TNF-α、IL-6和ICAM-1含量。

1.4.6 采用蛋白质印迹法检测肾组织TLR4、NF-κB、TGF-β1、磷酸化Smad2、磷酸化Smad3、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达水平：取右侧肾脏，参照“1.4.5”项下方法进行肾脏组织匀浆、裂解，4 ℃、12 000 r/min(离心半径10 cm)离心取上清液，测定总蛋白后以30 μg蛋白量上样、凝胶电泳(80 V，40 min；160 V，90 min)分离蛋白、湿法转聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(300 mA，90 min)、5%脱脂奶粉常温封闭90 min后，加目标蛋白[TLR4(1 ∶ 1 000)、NF-κB(1 ∶ 1 000)、TGF-β1(1 ∶ 1 000)、磷酸化Smad2(1 ∶ 800)、磷酸化Smad3(1 ∶ 800)、Ⅰ型胶原蛋白(1 ∶ 1 000)、Ⅲ型胶原蛋白(1 ∶ 1 000)]和β-actin(1 ∶ 2 000)一抗4 ℃孵育12 h，TBST洗膜后加二抗(1 ∶ 3 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜后加ELC发光剂，通过凝胶成像仪显示蛋白条带，以β-actin为内参、通过条带灰度值半定量目标蛋白表达。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 穿心莲内酯对MN大鼠24 h尿蛋白定量和血清SCr含量的影响

模型组大鼠24 h尿蛋白定量和血清SCr含量均明显高于正常组(P<0.01)；穿心莲内酯组和贝那普利组24 h尿蛋白定量和血清SCr含量均明显低于模型组(P<0.01)；穿心莲内酯组24 h尿蛋白定量和血清SCr含量均明显低于贝那普利组(P<0.05)，上述差异均有统计学意义，见表1。

表1 穿心莲内酯对MN大鼠24 h尿蛋白定量和血清SCr含量的影响Tab 1 Effects of andrographolide on 24 h urinary protein quantification and serum SCr in MN rats

2.2 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织病变的影响

HE染色和Masson染色结果显示，正常组大鼠肾组织形态结构未见异常；模型组大鼠可见肾细胞固缩、肾间质炎细胞浸润、肾小球及间质区大量胶原沉积等病理学改变；与模型组比较，穿心莲内酯组和贝那普利组肾组织病变均明显减轻，肾小球和肾间质仅可见丝状胶原沉积，其中穿心莲内酯组效果更为显著，见图1—2。模型组的CVF明显高于正常组[(23.71±3.80)%vs.(9.54±1.29)%，P<0.01]；穿心莲内酯组、贝那普利组的CVF明显低于模型组[(12.09±2.41)%vs.(23.71±3.80)%，(15.38±2.75)%vs.(23.71±3.80)%，P<0.01]；穿心莲内酯组的CVF明显低于贝那普利组[(12.09±2.41)%vs.(15.38±2.75)%，P<0.05]，上述差异均有统计学意义。

A.正常组；B.模型组；C.穿心莲内酯组；D.贝那普利组A.normal group;B.model group;C.andrographolide group;D.benazepril group图1 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织病变的影响(HE染色)Fig 1 Effects of andrographolide on renal tissue lesions in MN rats (HE staining)

A.正常组；B.模型组；C.穿心莲内酯组；D.贝那普利组A.normal group;B.model group;C.andrographolide group;D.benazepril group图2 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织纤维化的影响(Masson染色)Fig 2 Effects of andrographolide on renal tissue fibrosis in MN rats (Masson staining)

2.3 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织超微结构病变的影响

正常组肾组织基底膜、足突形态正常，上皮下未见电子致密物沉淀；模型组肾组织可见基底膜不规则增厚，足突排列紊乱、部分消失或融合，上皮下可见大量电子致密物沉积等超微结构病变；与模型组比较，穿心莲内酯组和贝那普利组肾组织超微结构病变均明显减轻，其中穿心莲内酯组效果更为显著，见图3。

A.正常组；B.模型组；C.穿心莲内酯组；D.贝那普利组A.normal group;B.model group;C.andrographolide group;D.benazepril group图3 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织超微结构变化的影响(×10 000)Fig 3 Effects of andrographolide on ultrastructural changes of renal tissue in MN rats (×10 000)

2.4 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织TNF-α、IL-6和ICAM-1含量的影响

模型组的TNF-α、IL-6和ICAM-1含量明显高于正常组(P<0.01)；穿心莲内酯组和贝那普利组的TNF-α、IL-6和ICAM-1含量均明显低于模型组(P<0.01)；穿心莲内酯组的TNF-α、IL-6和ICAM-1含量明显低于贝那普利组(P<0.05或P<0.01)，上述差异均有统计学意义，见表2。

表2 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织TNF-α、IL-6和ICAM-1含量的影响Tab 2 Effects of andrographolide on contents of TNF-α,IL-6,ICAM-1 in renal tissue of MN rats

2.5 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织TLR4、NF-κB蛋白表达水平的影响

模型组大鼠肾组织TLR4、NF-κB蛋白表达水平明显高于正常组(P<0.01)；穿心莲内酯组和贝那普利组TLR4、NF-κB蛋白表达水平明显低于模型组(P<0.01)；穿心莲内酯组TLR4、NF-κB蛋白表达水平明显低于贝那普利组(P<0.01)，上述差异均有统计学意义，见图4、表3。

A.正常组；B.模型组；C.穿心莲内酯组；D.贝那普利组A.normal group;B.model group;C.andrographolide group;D.benazepril group图4 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织TLR4、NF-κB蛋白表达水平的影响Fig 4 Effects of andrographolide on expressions of TLR4,NF-κB protein in renal tissue of MN rats

表3 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织TLR4、NF-κB蛋白表达水平的影响Tab 3 Effects of andrographolide on expressions of TLR4,NF-κB protein in renal tissue of MN rats

2.6 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织TGF-β1、磷酸化Smad2和磷酸化Smad3蛋白表达水平的影响

模型组大鼠肾组织TGF-β1、磷酸化Smad2和磷酸化Smad3蛋白表达水平明显高于正常组(P<0.01)；穿心莲内酯组和贝那普利组TGF-β1、磷酸化Smad2和磷酸化Smad3蛋白表达水平明显低于模型组(P<0.01)；穿心莲内酯组TGF-β1、磷酸化Smad2和磷酸化Smad3蛋白表达水平明显低于贝那普利组(P<0.01)，上述差异均有统计学意义，见图5、表4。

表4 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织TGF-β1、磷酸化Smad2、磷酸化Smad3蛋白表达水平的影响Tab 4 Effects of andrographolide on expressions of TGF-β1,phosphorylated Smad2,phosphorylated Smad3 protein in renal tissue of MN rats

A.正常组；B.模型组；C.穿心莲内酯组；D.贝那普利组A.normal group;B.model group;C.andrographolide group;D.benazepril group图5 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织TGF-β1、磷酸化Smad2和磷酸化Smad3蛋白表达水平的影响Fig 5 Effects of andrographolide on expressions of TGF-β1,phosphorylated Smad2,phosphorylated Smad3 protein in renal tissue of MN rats

2.7 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达水平的影响

模型组大鼠肾组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达水平明显高于正常组(P<0.01)；穿心莲内酯组和贝那普利组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达水平明显低于模型组(P<0.01)；穿心莲内酯组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达水平明显低于贝那普利组(P<0.01)，上述差异均有统计学意义，见图6、表5。

A.正常组；B.模型组；C.穿心莲内酯组；D.贝那普利组A.normal group;B.model group;C.andrographolide group;D.benazepril group图6 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达水平的影响Fig 6 Effects of andrographolide on expressions of type Ⅰ and type Ⅲ collagen protein in renal tissue of MN rats

表5 穿心莲内酯对MN大鼠肾组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达水平的影响Tab 5 Effects of andrographolide on expressions of type Ⅰ and type Ⅲ collagen protein in renal tissue of MN rats

3 讨论

MN是成人肾病综合征的主要致病因素，具有高发病率和高风险性，并呈现年轻化趋势，严重威胁着人们的生命健康。有研究结果发现，MN患者并发肾纤维化的比例>60%[10]。蔡小凡等[11]的研究结果表明，肾纤维化发生程度是决定肾脏疾病预后的重要因素，抑制纤维化能够有效延缓MN向终末期生的转变。目前，临床上对于MN的治疗主要采取糖皮质激素联合免疫抑制剂的方案[12-13]。但肾纤维化得不到很好的控制，是MN治疗中仍待解决的难题。

中医药在我国具有悠久的应用历史，MN在中医属于“尿浊”“水肿”等范畴，其病机在于“脾肾亏虚，水湿、痰浊、瘀血、浊毒潜藏肾络”，日久则肾络癥积，形成肾纤维化[14]。穿心莲属于爵床科穿心莲属一年生草本植物，其干燥地上部分入药，性寒、味苦，具有清热解毒、凉血消肿的功效。穿心莲内酯为穿心莲的主要活性成分，属于二萜类内酯化合物，具有抗炎、免疫调节等多种生物学活性，对急性肾衰竭、糖尿病肾病和原发性肾病综合征等多种肾脏疾病具有治疗作用[15-16]。此外，Das等[17]的研究结果发现，穿心莲内酯能够通过抑制NF-κB通路抑制肾炎小鼠肾组织纤维化。贝那普利为血管紧张素转换酶抑制剂，能够明显改善MN大鼠的肾功能，降低尿蛋白量，是MN动物实验研究常用的阳性对照药物[18]。本研究通过尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白制备MN大鼠模型，24 h尿蛋白定量和血清SCr含量明显升高，肾组织呈现细胞固缩、炎症浸润、肾小球及间质区大量胶原沉积等病理学改变，并可见基底膜不规则增厚、足突排列紊乱、部分消失或融合、上皮下可见大量电子致密物沉积等超微结构病变，与高飞等[19]的研究结果一致。进一步研究发现，经穿心莲内酯或贝那普利治疗能够明显降低24 h尿蛋白定量和SCr含量，明显改善组织病变和超微结构病变，且穿心莲内酯(50 mg/kg)的效果优于贝那普利(10 mg/kg)，提示穿心莲内酯对MN大鼠肾组织纤维化等病变具有抑制作用，对肾功能具有改善作用。

肾纤维化机制复杂，多种因素参与其病理进展过程。MN所致肾脏免疫微环境改变，肾小球细胞、肾间质细胞和系膜细胞等释放TNF-α、IL-6及ICAM-1等炎症细胞因子，致使肾间质炎症细胞浸润而引发炎症反应。杨霜等[24]和郑铁骑等[25]的研究结果发现，炎症反应能够促进肾细胞表型转化，进而释放肾毒性因子、生长因子等，促进肾纤维化。IL-6主要由系膜细胞释放，能够促进EMC生成。高雅婵等[26]的研究结果发现，IL-6的促纤维化作用与IL-6含量呈正相关。TNF-α具有炎症趋化因子属性，能够进一步促进炎症细胞因子释放，并促进前列腺素、单核细胞趋化蛋白-1等表达，促进ICAM-1表达与释放而增加内皮通透性和炎症细胞浸润，从而促进肾纤维化进展[27]。Toll样受体(TLR)是一类跨膜识别受体，在机体免疫应答及炎症反应调节过程中发挥着重要的信号传导作用；NF-κB为TLR4下游靶基因，能够被TLR4诱导表达与活化，活化NF-κB核转位后能够诱导TNF-α、IL-6和ICAM-1等炎症因子释放，从而加重炎症反应[28]。因此，TLR4/NF-κB信号通路在炎症反应过程中具有重要调控作用。本研究结果显示，经穿心莲内酯或贝那普利治疗能够明显降低MN大鼠肾组织TNF-α、IL-6和ICAM-1含量，下调TLR4、NF-κB表达，与Li等[29]的研究结果一致，且穿心莲内酯(50 mg/kg)的效果优于贝那普利(10 mg/kg)，提示穿心莲内酯对MN大鼠的炎症反应具有抑制作用，从而间接抑制肾纤维化，其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。

综上所述，穿心莲内酯对MN大鼠肾纤维化具有抑制作用，可能与抑制TLR4/NF-κB通路和TGF-β1/Smad通路，进而抑制炎症反应和细胞外基质生成有关。本研究结果为穿心莲内酯作为MN治疗备选药物提供了理论支持。