水酶法提取南板蓝根叶中靛蓝色素

刘卉琳 ，黄染林 ，曲 超 ，刘 绍

（1. 湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2. 湖南汇湘轩生物科技股份有限公司，湖南 长沙 410323）

蓝色是三原色之一，在食品、印染等行业有着重要的用途。自然界中并不缺少蓝色素，然而目前用于食品加工的蓝色素多为合成蓝色素[1]，完全符合工业需求的天然蓝色素却很少见。随着人们对食品质量和商品安全性的要求不断提高，天然色素的提取和应用逐渐成为研究热点[2-4]。例如：陈林[5]从板蓝根中提取靛蓝色素对牛仔布纱线进行染色试验，结果表明，天然靛蓝具有良好的染色深度和染色牢度，可替代化学靛蓝用于牛仔布的染色，特别是用于贴身穿着的衬衣和牛仔裤的中浅色染色，对人体无毒无害。

南板蓝根别称马蓝、大青叶，是爵床科多年生草本植物，根茎叶均具有一定药用价值[6]。研究发现，该药材除了具有生物碱、黄酮、萜类、木脂素类等多种活性成分外[7-11]，其靛蓝色素的含量也较高，且在特定光波长下其吸光度与靛蓝浓度（100～150 mg/mL）有较好的线性关系[12-13]。

常见的靛蓝提取方法主要有微生物发酵和有机溶剂提取2 种[14-19]。其中，有机溶剂提取法成本较高，提取率低，且化学物质残留较多，有些还具有一定毒性，对靛蓝后续应用产生不利影响，对环境也不友好。而微生物发酵一般是将含靛蓝的植物置于室温发酵池内浸泡7 d，待发酵池滋生大量微生物，散发出腐烂腥臭味后捞出，再往发酵池中加入一定比例的生石灰，用力搅拌1 h，直到有蓝色泡沫浮起为止。该提取方法耗时较长，产生的工业废水多，环保压力大。因此，如何缩短提取时间、提高提取效率，并尽量降低污染是目前天然靛蓝色素提取急需解决的关键问题。笔者以南板蓝根为原料，首次探索了水酶法提取南板蓝根中靛蓝色素的工艺流程，并通过单因素试验和正交试验优化了工艺参数，该方法大大缩短了靛蓝提取时间，提高了效率，且提取过程符合绿色环保要求。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试原料为南板蓝根干叶，于2021 年5—6 月在贵州采摘干燥。主要试剂有复合酶制剂（食品级，湖南尤特尔生物科技有限公司）、靛蓝标准品（上海染料研究所）。主要仪器设备有电子天平（上海菁海仪器有限公司）、分析天平（湘仪天平仪器设备有限公司）、恒温水浴锅（北京国华医疗器械厂）、紫外可见分光光度计（天津冠泽科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 南板蓝根中靛蓝色素提取的工艺流程称取南板蓝根干叶，以蒸馏水为溶剂按一定比例混合，加入一定量的复合酶，调整pH 值后在水浴锅中进行恒温提取，提取结束后用紫外可见分光光度计测定提取液吸光度，测定3 次，取平均值。

1.2.2 检测波长的确定采用紫光分光光度计进行吸光度测定。配制浓度为0.05 mg/mL 的靛蓝标准溶液，置于312～812 nm 波长[20]范围内进行吸光度的比较，确定靛蓝色素最大的吸收波长为检测波长。

1.2.3 样品中色素提取率的计算精确称取0.000 2 g（精确至0.000 1 g）纯度为95%的靛蓝标准品，转移至1 000 mL 容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，配制成0.2 mg/L 靛蓝标准溶液备用。从中分别取1、2、3、4和5 mL 定容至100 mL 容量瓶中，配制成浓度为0.002、0.004、0.006、0.008 和0.010 mg/L 的靛蓝标准溶液，以蒸馏水作为参照，以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得到标准曲线。然后测定水酶法提取液在最大吸收波长处的吸光度值，代入标准曲线获得提取液中的色素浓度，再根据公式（1）计算靛蓝提取率。

式中，c为粗提靛蓝浓度（mg/L），10 为稀释10 倍，V为提取液体积（L），m为南板蓝根质量（g）。

1.2.4 单因素试验（1）提取温度。在料液比为1 ∶20（g/mL）、加酶量为6 g/L、pH 值为5、提取时间为3 h 的条件下，将提取温度设置为30、40、50、60 和70℃，研究提取温度对靛蓝色素提取率的影响。（2）提取时间。在料液比为1 ∶20、加酶量为6 g/L、pH值为5、提取温度为50℃的条件下，分别提取1.5、2.0、2.5、3.0 和3.5 h，研究提取时间对靛蓝色素提取率的影响。（3）加酶量。在料液比为1 ∶20、pH 值为5、提取温度为50℃、提取时间为3 h 的条件下，分别添加4、5、6、7 和8 g/L 的复合酶，研究加酶量对靛蓝色素提取率的影响。（4）pH 值。在料液比为1 ∶20、加酶量为6 g/L、提取温度为50℃、提取时间为3 h 的条件下，调整pH 值为3、4、5、6 和7，研究pH 值对靛蓝色素提取率的影响。（5） 料液比。在加酶量为6 g/L、pH 值为5、提取温度为50℃、提取时间为3 h的条件下，分别配置1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40 和1 ∶50的料液比，研究料液比对靛蓝色素提取率的影响。

1.2.5 正交试验根据单因素试验结果，选取对靛蓝色素提取率影响较大的3 个因素进行正交试验，以靛蓝色素提取率为考察指标，确定最优工艺参数。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

由图1 可知，靛蓝标准溶液在612 nm 处呈现最高峰，因此将靛蓝色素的检测波长确定为612 nm。

图1 标准靛蓝溶液吸收光谱曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取温度由图2 可看出，随着提取温度的增加，靛蓝的提取率先升高后降低；当提取温度为30～70℃时，提取率从0.105%升到0.207%后又降至0.075%，变化差异显著（P＜0.05），说明提取温度对靛蓝提取的影响较大，当提取温度为50℃时提取率达到最大值。这是因为50℃为复合酶的最适作用温度，若温度继续升高，酶的构象发生改变，酶活性大大降低，导致提取率下降。因此，后续试验选定50℃为南板蓝根中靛蓝提取的最佳温度。

图2 不同提取温度下的靛蓝提取率

2.2.2 提取时间由图3 显示，随着提取时间的增加，靛蓝提取率先升高后降低，提取时间从1.5 h 增至3.5 h，靛蓝提取率从0.173%升高至0.196%再降至0.183%，最大值与最小值之间差异达显著水平（P＜0.05），但提取率居中的3 个处理间差异不显著（P＞0.05），说明提取时间对靛蓝提取的影响较小。当提取时间为3.0 h 时，靛蓝提取率达到最大值，3.0 h 后提取率呈现细微下降趋势。这说明提取时间达到3.0 h，酶与南板蓝根已充分接触和反应，靛蓝溶出已达到极限。超过一定时间，部分靛蓝色素分解。因此，在该试验条件下南板蓝根中靛蓝提取的最佳时间应为3.0 h。

图3 不同提取时间下的靛蓝提取率

2.2.3 加酶量由图4 可看出，当加酶量为4～8 g/L 范围内，靛蓝提取率随着加酶量的增加呈先升高后稍降低并趋于平缓的趋势；以加酶量为6 g/L 的处理提取率最大，为0.189%；以加酶量为4 g/L 的处理提取率最低，为0.170%；二者差异达显著水平（P＜0.05），但其他3 个加酶量处理间的差异不显著（P＞0.05），说明加酶量对靛蓝色素提取的影响较小。在加酶量为6 g/L 时靛蓝提取率达到最高，表明提高加酶量可以增加分子之间的碰撞，加快反应速度，显著催化靛蓝的生成，但当南板蓝根与复合酶充分结合后，继续增加酶用量对靛蓝生成没有明显作用。因此，在该试验条件下南板蓝根中靛蓝提取的最适加酶量应为6 g/L。

图4 不同加酶量下的靛蓝提取率

2.2.4 pH值 由图5 可得，依次调整pH 值为3～7，靛蓝提取率从0.106%升高至0.202%再降至0.125%，靛蓝提取率变化显著（P＜0.05），说明酶活力受pH值影响较大。这一变化的原因在于该试验用的复合酶以纤维素酶为主，其最适pH 值为5，高于或低于最适pH 值酶活性均受到影响，导致底物无法与酶有效结合，故靛蓝提取率降低。因此，后续试验应将pH值控制在5 左右。

图5 不同pH 值下的靛蓝提取率

2.2.5 料液比由图6 可得，靛蓝提取率在料液比为1 ∶20 时达到最大值，为0.187%，提高或降低料液比均会使靛蓝提取率下降；料液比为1∶50时提取率最低，与最大值差异显著（P＜0.05），说明料液比对靛蓝提取的影响较大。当溶剂过少时，南板蓝根无法充分溶解在溶剂中，产生的靛蓝较少；而溶剂过多时，南板蓝根与溶剂已反应完全，靛蓝无法继续溶出，与此同时，继续加入溶剂会带来新的杂质，稀释靛蓝的浓度，使提取液中靛蓝的相对浓度降低。因此，在该试验条件下南板蓝根中靛蓝提取的最佳料液比应为1 ∶20。

图6 不同料液比的靛蓝提取率

2.3 正交试验结果

单因素试验表明，提取时间和加酶量对靛蓝提取率的影响较小，因此选用提取温度（A）、料液比（B）、pH 值（C）进行3 因素3 水平正交试验（表1）。由表1 的极差（R）值可知，各因素对靛蓝提取率影响程度最大的是提取温度，其次是pH 值，最后是料液比；最优工艺条件组合为A2B2C2，即提取温度50℃、pH值为5、料液比1 ∶20。由于该条件不在正交试验设计的9 个处理中，故需进一步进行验证试验。验证结果显示，在最优条件下测得提取率为0.218%，比正交试验9 个处理中最佳组合（A2B1C2）的提取率（0.214%）稍高，说明A2B2C2具有可行性，是该研究获取的南板蓝根中靛蓝提取最优工艺参数。

表1 正交试验设计及结果

由表2 可知，3 个因素对靛蓝色素提取效果的影响程度不同。其中提取温度对靛蓝吸光度影响极显著（P＜0.01），pH 值对靛蓝吸光度的影响显著（P＜0.05），料液比对靛蓝吸光度影响不显著（P＞0.05）。由F值大小可知，不同因素对吸光度影响的主次水平为A ＞C ＞B，提取温度对吸光度的影响最大，料液比对吸光度的影响最小。

表2 正交试验方差分析结果

4 结论与讨论

研究采用了水酶法对南板蓝根中的靛蓝色素进行提取，以提取率为考察指标，分析提取时间、提取温度、加酶量、pH 值和料液比对靛蓝色素提取效果的影响，优化了水酶法提取靛蓝色素工艺，结果表明，在料液比1 ∶20、加酶量6 g/L、pH 值5、提取温度50℃和提取时间3 h 的条件下，靛蓝提取率最高，为0.218%。该方法大大缩短了提取时间，提高了提取效率，且产生的污染较少，达到了绿色环保要求。所提取的靛蓝色素可广泛应用于食品、日化、印染等领域。