贵州喀斯特地区红茶中茶黄素含量的测定

吴华秀，吴新文，毛敏霞，黄永桥

（贵州省检测技术研究应用中心，贵州贵阳 550014）

茶黄素具有抗氧化、抑菌、抗炎、防癌、抗肿瘤以及防治心血管疾病等功能[1]。其是由多酚类及其衍生物氧化缩合而成，是一类具有苯骈卓酚酮结构的化合物的总称，现已发现的茶黄素有12种，其中茶黄素TF、茶黄素单没食子酸酯TF-3-G、茶黄素单没食子酸酯TF-3’-G和茶黄素双没食子酸酯TFDG是4种最主要的茶黄素[2]。茶黄素是红茶中的主要成分，对红茶的色香味及品质起着决定性的作用。红茶中茶黄素含量的高低与用于制作红茶的茶树品种所生长的环境有很大的关系，以碳酸岩为主的地质环境更有利于红茶的生产[3-5]。

目前有关茶黄素的测定一般有分光光度法[6]、毛细管电泳法[7]、液相色谱-串联质谱法[8-10]、高效液相色谱法[11-17]等。在国标和各类文献[6-17]中对红茶样品中茶黄素的提取和测定方法条件参数都各不相同，有利有弊。本文采用高效液相色谱法测定红茶中的茶黄素含量，通过对提取溶剂、提取时间、提取温度等条件进行试验，优化并规范了测定红茶中茶黄素的前处理方法，再对流动相进行对比分析，找到最优的色谱条件，避免了实际样品带来的杂质干扰问题，满足测定红茶中茶黄素的定性和定量要求，保证了茶黄素含量分析的准确性。采用该方法对全国10种红茶及贵州喀斯特山区12个茶树品种红茶中的茶黄素含量进行测定，为分析贵州喀斯特山区红茶品质提供数据依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

贵州生产加工的12个茶树品种红茶；其他地区品种红茶（正山小种红茶、祁门工夫、滇红工夫、川红工夫、宁红工夫、闽红工夫、湖红工夫、宜红工夫、越红工夫以及九曲红梅）均购于贵阳市各大型超市。

乙腈（色谱纯），德国Merck公司；甲醇（分析纯）、乙酸乙酯（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；冰乙酸（色谱纯）、茶黄素（TF）、茶黄素单没食子酸酯（TF-3’-G）、茶黄素单没食子酸酯（TF-3’-G）、茶黄素双没食子酸酯（TFDG）（纯度均大于98%）以及0.22 μm PTFE针式滤膜，上海安谱实验科技股份有限公司。

Agilent 1290高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器），美国Agilent公司；数显恒温水浴锅，江苏省常州市金坛区水北科普实验仪器厂；LT2002电子天平，常熟市天量仪器有限公司；离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；Milli-Q超纯水机，美国Millipore公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制

分别称取4种茶黄素化合物标准品10 mg（精确至0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，甲醇溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度均为1.00 mg·mL-1的标准储备液，-18 ℃保存。分别取4种茶黄素化合物标准储备液各2.00 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成200.00 μg·mL-1的混合标准溶液，备用。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：2%乙酸水溶液；流动相B：乙腈+乙酸乙酯（42+3）；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；DAD检测器波长：280 nm；梯度洗脱：0～16 min，15% B；16～25 min，20% B；25～35 min，20%→24% B；35～37 min，24%→15% B；37～40 min，15% B。

1.2.3 样品前处理

称0.5 g（精确至0.001 g）样品，加入10 mL 70%甲醇水溶液，在80 ℃水浴中提取10 min，取出冷却至室温，离心，取上清液，于25 mL容量瓶中，重复提取1次，合并上清液于容量瓶中，加70%甲醇溶液定容至刻度，混匀，过膜，上机测定。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取溶剂浓度对茶黄素提取率的影响

试验发现使用一定浓度的甲醇溶液为提取溶剂时，在一定温度的水浴中直接提取的前处理方法的提取效率更高。本文选择50%、60%、70%、80%、90%以及100%的甲醇溶液，在相同温度水浴中提取10 min，提取2次，结果如图1所示。由图1可知，不同浓度的甲醇对茶黄素的提取率影响较大，甲醇浓度太低时，茶黄素在溶剂中的溶解度较低，提取速率变慢，造成茶黄素的提取率偏低；随着甲醇浓度的提高，茶黄素的提取率不断提高。甲醇浓度在60%～80%时，茶黄素的含量基本保持不变，当甲醇浓度达到90%后，由于水分含量太低，不利于样品快速软化溶解，导致茶黄素提取困难，提取率开始降低，同时随着甲醇浓度的提高，样品杂质干扰也越来越严重。因此，甲醇浓度为70%时，既能保证较高的提取率，样品杂质干扰也较少。

图1 提取溶剂浓度的选择

2.1.2 提取温度对茶黄素提取率的影响

提取温度的高低会直接影响茶黄素的提取效率，试验选择70%的甲醇为提取溶剂，分别在60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃以及85 ℃水浴中提取10 min，提取2次，结果如图2所示。由图2可知，当提取温度达到80 ℃时，继续提高提取温度，茶黄素提取率无明显增加，这是由于提取温度过高，提取溶剂会沸腾，不利于试验的进行。另外，温度过高会加速茶黄素的氧化分解，不利于试验的控制。综合考虑，提取温度选择80 ℃时为最佳。

图2 提取温度的选择

2.1.3 提取时间对茶黄素提取率的影响

提取时间的长短直接影响茶黄素的提取效果，试验选择70%的甲醇为提取溶剂，在80 ℃的水浴中分别提取5 min、10 min、15 min、20 min、25 min以及30 min，提取2次，结果如图3所示。由图3可知，提取时间低于10 min时，茶黄素提取不充分，茶黄素提取率低；提取时间达到10～15 min时，茶黄素含量增长缓慢，随着提取时间的继续延长，提取效率逐渐降低。因此，提取时间选择15 min为最佳。

图3 提取时间的选择

2.2 样品前处理正交设计

根据单因素试验结果，选择对试验有影响的提取溶剂浓度（A）、提取温度（B）、提取时间（C）这3个因子进行L9(33)正交试验，以茶黄素总含量为考察指标，正交试验因素水平表见表1，正交试验结果见表2。由表2可知，经极差分析（R）分析可知，影响红茶中姜黄素总含量的因素大小为A＞C＞B，即提取溶剂浓度和提取时间是影响红茶中茶黄素提取率的关键性因子，而提取温度对其的影响最小。从表2可以看出，茶黄素总含量最高的组合为A3B3C2，结果为0.849%；由K值分析得到的最佳组合为A3B2C3，即用70%的甲醇为提取溶剂，在75 ℃的水浴中提取15 min，提取2次，得到最佳条件下，茶黄素总含量为0.853%，高于组合A3B3C2。因此，试验得到的最佳组合为A3B2C3。

表1 正交试验因素水平表

表2 L9(34)正交试验设计及结果

2.3 色谱条件的选择

2.3.1 流动相的选择与优化

文献表明[12]，在流动相中加入乙酸乙酯对目标物的分离度有较大影响。通过改变乙酸乙酯的浓度可以调节4种茶黄素的分离度、峰形及保留时间，通过优化最后选择A：2%乙酸水溶液、B：乙腈+乙酸乙酯（42+3）作为流动相时，目标物分离度、峰形等均为最佳。标准溶液及实际样品图谱如图4所示，分析时间为40 min，缩短了分析时间，实际样品测定中杂质干扰小、出峰顺序及保留时间与标准溶液出峰顺序及保留时间保持一致。

图4 标准溶液（A）及实际样品（B）图谱

2.3.2 色谱柱的选择

流动相的pH值在2左右，ZORBAX SB-C18能耐受的pH值范围为1～8，在保证具有良好的分离度和峰型的同时，该色谱柱能耐受较低pH值的流动相，在分析样品时可以保证色谱柱不被损坏，保证色谱柱的正常使用寿命，所以最后选择该色谱柱。

2.3.3 检测波长的选择

用DAD检测器对4种茶黄素进行光谱扫描，4种茶黄素均在波长为280 nm左右处有最大吸收值，4种茶黄素的响应值最佳，干扰较小。因此，选择280 nm作为4种茶黄素的检测波长。

2.4 标准曲线与最低检出限

配制质量浓度为2.00～200.00 μg·mL-1系列标准溶液，以标准溶液的峰面积和浓度计算回归方程，结果见表3，在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数R2＞0.999；通过S/N=3计算得出茶黄素（TF）、茶黄素单没食子酸酯（TF-3-G）、茶黄素单没食子酸酯（TF-3’-G）以及茶黄素双没食子酸酯（TFDG）的检出限结果。

表3 检出限和线性范围

2.5 精密度及加标回收试验

选择3个添加水平进行加标回收试验，每个水平做6次加标回收试验，结果见表4，平均回收率均在95.9%～98.2%，精密度在1.5%～4.7%，说明该方法具有较好的重复性与准确性。

表4 回收率和精密度（n=6）

2.6 红茶样品的测定

2.6.1 贵州茶树品种红茶中茶黄素的含量

采用建立的分析方法对贵州12种茶树品种的27批次红茶进行茶黄素含量的测定，结果见表5。不同品种红茶中4种茶黄素及茶黄素总量的含量存在一定差异。其中，TF含量为0.01%～0.17%，TF-3-G含 量 为0.10%～0.26%，TF-3’-G含 量 为0.04%～0.14%，TFDG含 量 为0.16%～0.64%。TFDG含量高于其他3种茶黄素，金牡丹二叶中4种茶黄素及茶黄素总量均为最高，分别为0.17%、0.26%、0.14%、0.43%及1.00%；丹桂-2和古树-1的茶黄素总量含量最低，均为0.46%。

表5 贵州12个茶树品种红茶中茶黄素的含量

2.6.2 其他地区10种红茶中茶黄素的含量

采用建立的分析方法对其他10种红茶中茶黄素的含量进行测定，结果见表6。湖红工夫中茶黄素总量高于其他几种红茶，为0.73%；九曲红梅中茶黄素总量最低，为0.38%；宁红工夫和湖红工夫中TFDG的含量为10种红茶中最高，为0.37%。

表6 其他10种红茶中茶黄素的含量

综上，不同品种红茶中4种茶黄素及茶黄素总量的含量存在一定差异，贵州茶树品种红茶中茶黄素总量在0.46%～1.00%，其他地区红茶品种茶黄素总量在0.38%～0.73%，且贵州茶树品种红茶中平均茶黄素总量高于其他地区红茶品种；TFDG含量高于其他3种茶黄素，TF含量均为最低，金牡丹二叶中茶黄素总量含量最高，九曲红梅中茶黄素总量含量最低，419-3茶中TFDG含量为所测红茶中最高，为0.64%。

3 结论

通过对前处理方法和仪器条件进行优化，建立了高效液相色谱测定红茶中茶黄素的分析方法，方法线性和精密度良好，可用于实际样品检测。采用该方法对贵州茶树品种红茶中和其他地区红茶品种中茶黄素的含量进行测定，通过分析发现全国10种红茶中4中茶黄素的含量在0.38%～0.73%，平均含量为0.57%；贵州喀斯特山区12个茶树品种红茶中，4种茶黄素的含量在0.46%～1.00%，平均含量为0.67%。结果表明，不同品种红茶中4种茶黄素及茶黄素总量的含量存在一定差异，贵州喀斯特山区中的茶树生产出来的红茶比其他地区10种红茶中茶黄素总量的平均含量要高出0.10%，这可能与贵州喀斯特山区以碳酸岩为主的地质背景有关。