六堡茶中茶色素的测定

罗达龙，王 华，覃 蓝，蒋德莉，文俊萍，杨梓莹，宋 妤

（1.梧州市食品药品检验所，广西梧州 543000；2.梧州市天誉茶业有限公司，广西梧州 543000；3．广西速溶六堡茶工程技术研究中心，广西梧州 543000）

六堡茶是具有独特槟榔香气的黑茶品种，属于后发酵茶。六堡茶汤色红浓明亮，口感醇和爽滑，香气纯陈，具有越陈越香的特性。贮存年份对六堡茶的品质以及茶叶中茶多酚、氨基酸、茶黄素、茶红素和茶褐素等内含成分都会产生影响[1-5]。茶色素是茶叶体内具有生物活性的一系列天然色素的总称，主要由水溶性色素和脂溶性色素组成。六堡茶含有儿茶素、氨基酸、咖啡碱、维生素等生物活性物质，不同陈化时间的六堡茶中茶褐素含量在9.49%～16.29%。随着陈化时间的增加，六堡中茶色素含量逐渐增加，且增加明显。

目前只有《红茶中茶红素和茶褐素含量的测定分光光度法》（NY/T 3675—2020）进行红茶中茶褐素的测定，而红茶的基质与六堡茶差异较大，标准中的罗勃兹经验系数不适用于六堡茶中茶色素的测定，得到的结果与实际情况相差较大，不能准确获得六堡茶中茶色素含量。六堡茶在降糖、降脂、抗氧化方面有一定功效，而茶色素在这些功效中发挥着至关重要的作用，故建立一种能对六堡茶中茶色素进行定量测定的方法尤为重要。本实验采用该方法分析10个不同批次的六堡茶中茶色素含量，该方法的重复性、回收率、线性关系、灵敏度均较好，适用于六堡茶中茶色素含量的测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

六堡茶样品均来源于广西。

无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；二甲基亚砜（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为经ELGA PURELAB Classic UVF净化系统制备的去离子水。

1.2 仪器与设备

UV2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；GC 7890B-7000C配备7697A顶空进样器气相色谱质谱联用仪（美国Agilent公司）；EZ-2平行浓缩仪（英国Genevac公司）；PURELAB Classic UVF超纯水机（英国ELGA公司）；XA205DU电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；3K15高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；FD115鼓风电热恒温干燥箱(德国Binder公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 茶色素对照品制备

取30批经过评茶师评定等级为1级的六堡茶样品，各批次称取150 g，混合得到标准六堡茶样品，随后将该标准六堡茶样品与沸水按1∶10的比例进行浸泡，并在沸水浴中密封提取40 min，提取2次。使用纱布趁热过滤提取后茶汤（过滤接收容器放置于冰浴中），收集到的茶汤使用平衡浓缩仪浓缩后得标准品浓缩液。向标准品浓缩液加入无水乙醇试剂，加入无水乙醇的量占溶液总量的90%，混合均匀后放置到4 ℃冰箱静置3 h，9 000 r·min-1下4 ℃冷冻离心15 min，得到沉淀物1。向沉淀物1加入乙酸乙酯试剂，加入乙酸乙酯的量占溶液总量的90%，混合均匀后放置到4 ℃冰箱静置3 h，9 000 r·min-1下4 ℃冷冻离心15 min，得到沉淀物2。沉淀物2在（65±2）℃烘箱下烘干1.5 h，得到茶色素粗品。取茶色素粗品5 g，用超纯水溶解至100 mL，通过滤膜（＞50 000 Da的滤膜），再使用冷冻干燥得到茶褐素精品，作为茶色素对照品。

采用顶空-气相色谱质谱法（Headspace-Gas Chromatography-Mass Spectrometry，HS-GC-MS）对茶色素对照品中的残留溶剂乙醇、乙酸乙酯进行测定，使用公式[纯度=100%-残留溶剂含量（%）]计算出对照品的纯度，以完成茶色素对照品纯度的标定，茶色素对照品需避光密封保存在2～8 ℃冰箱。

1.3.2 茶色素对照品中乙醇、乙酸乙酯残留溶剂测定

（1）色谱条件。DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；分流比：20∶1；色谱柱温度：初始温度40 ℃，保持时间5 min，以20 ℃·min-1升至200 ℃，保持时间3 min，以60 ℃·min-1升至240 ℃，保持时间1 min；柱流量：1.2 mL·min-1。

（2）质谱条件。离子源温度：230 ℃；电子能量；70 eV；选择离子检测（SIM）；乙醇离子质荷比：30、31、45、46；乙酸乙酯离子质荷比：43、45、61、70和88；顶空进样器加热箱温度：90 ℃；定量环温度：100 ℃；传输线温度：120 ℃；样品瓶平衡时间：15 min；进样持续时间：0.5 min。

（3）供试样品制备。精密称取茶色素对照品0.50 g，置5 mL容量瓶，加水溶解并定容至刻度，摇匀，吸取3.00 mL到20 mL顶空瓶内，待测定。

（4）对照品溶液配制。精密称取无水乙醇、乙酸乙酯试剂各1.00 g，置100 mL容量瓶（容量瓶内预先加入二甲基亚砜试剂80 mL），用二甲基亚砜试剂溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品储备液。吸取对照品储备液0.10 mL置于5 mL容量瓶，加水溶解并定容至刻度，摇匀，吸取3.00 mL到20 mL顶空瓶内，待测定。

1.3.3 六堡茶样品前处理

精密称取10个不同批次六堡茶样品各5.00 g，加入沸水（由超纯水煮沸得到）250 mL，搅拌均匀后在沸水浴中密封提取40 min，溶液趁热过滤（过滤接收容器放置于冰浴中）后放至室温，向滤液中加入无水乙醇试剂，加入无水乙醇的量占溶液总量的90%，混合均匀，4 ℃冰箱静置3 h，在9 000 r·min-1下4 ℃冷冻离心15 min，得到沉淀物。将沉淀物用水溶解，并转移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，精密吸取上述稀释液0.50 mL到50 mL容量瓶，用水定容至刻度，摇匀，得到样品待测溶液。

1.3.4 六堡茶样品测定

样品待测溶液使用紫外分光光度计进行测定，测定波长为280 nm±2 nm，比色皿厚度1 cm，以超纯水作为空白调零，测定样品吸光度。样品中茶褐素吸光度应落在0.1～0.7，如吸光度过高需对样品作进一步稀释。

2 结果与分析

2.1 线性关系

取1.3.1项下对照品，精密称定，加水稀释成浓度约1 000 μg·mL-1，作为储备液。分别精密吸取该储备液0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL和1.25 mL至10 mL容量瓶中，并1.3.4项下方法进行测定。以浓度（μg·mL-1）为横坐标（x），吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线求得回归方程为A=0.004 97x+0.027 45，茶色素标准曲线在25.66～128.30 μg·mL-1呈良好的线性关系，线性相关系数为0.997。

2.2 重复性试验

取10个不同批次的六堡茶样品，每个批次称取6份，每份5.00 g，精密称定，按1.3.3项下方法提取供试品溶液，1.3.4项下方法进行测定，测得10个不同批次六堡茶样品茶色素的平均含量在9.7%～14.2%，RSD分别为2.3%～4.2%，试验表明该提取方法重复性良好，结果见表1。

表1 10批六堡茶样品茶色素含量的重复性试验（n=6）

2.3 加标回收试验

取已测定含量的六堡茶样品，分别加入相当于样品中茶色素含量的0.5%、5.0%、15.0%对照品，每个级别进行3次加标试验。按1.3.3项下方法制备供试品溶液，按1.3.4项下方法进行测定，计算加标回收率。加标量在0.5%～15.0%时，平均回收率为92.6%～106.2%，结果见表2。

表2 基质加标回收率结果（n=3）

2.4 定量限试验

在空白溶液中精密加入适量1.3.1项下对照品，按1.3.3项下方法提取供试品溶液，1.3.4项下方法进行测定，茶色素吸光度应落在0.1～0.7，并以吸光度值最低点浓度作为定量限，得到该方法中茶色素的定量限为0.5%。

2.5 样品测定结果

10个不同批次的六堡茶样品茶色素含量为9.7%～14.2%，结果见表3。

表3 10批次六堡茶样品茶色素含量检测结果

3 结论与讨论

本方法通过使用顶空-气质色谱质谱法对纯化过程中的残留溶剂进行测定，来标定茶色素的纯度。顶空-气相色谱质谱法对于残留溶剂的检测比气相色谱法灵敏度更高，且质谱抗干扰能力更强，使用质荷比进行定性可以排除在气相色谱法法中由于色谱峰的干扰而导致的检测目标物检测不到的因素。顶空-气相色谱质谱法使用顶空进样器进样，设定加热箱温度只在残留物的沸点以上，可保证其余高于该沸点的物质不被挥发，不进到检测系统，进而减少污染。得到茶色素对照品后该对照品用于检测六堡茶中茶褐素，在基质上对照品的来源为六堡茶，使用同样基质来源的对照品进行检测能进一步排除由于基质不同而影响测定结果的因素。

通过该方法制备茶色素对照品，对六堡茶样品中的茶色素进行测定，重复性、回收率、线性关系和灵敏度都较好，适用于六堡茶中茶色素含量的测定。