宣肺止嗽合剂质量标准提高研究

李成明，王 瑞，张明童，李冬华，马 潇，朱仁愿

(1.甘肃省中医院药学部，甘肃兰州 730050；2.兰州市食品药品检验检测研究院，甘肃兰州 730050；3.甘肃省药品检验研究院，甘肃省中藏药检验检测技术工程实验室，国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室，甘肃兰州 730070)

宣肺止嗽合剂为《中国药典》2020年版(一部)收载品种，由荆芥、前胡、桔梗、蜜罂粟壳等10味中药组成，具有疏风宣肺、止咳化痰之功效，用于治疗风邪犯肺证咳嗽、症见咳嗽、咽痒、鼻塞流涕、恶寒发热、咯痰。现代临床研究表明，宣肺止嗽合剂可明显改善感冒后遗咳嗽，对治疗细菌性肺炎引起的咳嗽、痰多效果明显。方中蜜罂粟壳主要含吗啡等生物碱成分，具有镇痛、镇咳和抑制呼吸等药理作用，连续服用易产生依赖性、瘾癖，超剂量使用会出现呃逆、呼吸困难、昏迷等中毒症状。鉴于此，应对吗啡的含量进行严格控制。宣肺止嗽合剂的含量测定最早收载于《中国药典》2015年版一部，起草宣肺止嗽合剂含量测定方法时未充分考虑其原料药罂粟壳蜜制之后吗啡含量的变化以及原料药与成药之间的转移率，导致含量合格的蜜罂粟壳原料药进行投料出现含量不合格的宣肺止嗽合剂。另外《中国药典》2020年版一部采用HPLC法测定吗啡含量，但所用有机溶媒毒性强、前处理烦琐、易造成待测充分吗啡损失，同时对色谱柱的要求也较高。因此，该研究拟建立简便易行的测定宣肺止嗽合剂中吗啡含量的HPLC法，考察罂粟壳中吗啡转移率，制定较为合理的宣肺止嗽合剂中吗啡限量标准，为宣肺止嗽合剂的质量控制提供依据。

1 材料与方法

Waters E2695型高效液相色谱仪，美国Waters公司；ME24-102型万分之一电子天平、XS205DU十万分之一型电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-250E数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

吗啡对照品(批号171201-201324，含量≥93.9%)，购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，磷酸为优级纯，甲醇为分析纯，水为超纯水。5批罂粟壳药材购自甘肃普安制药有限公司，经马潇主任药师鉴定为罂粟科植物罂粟(L.)的干燥成熟果壳，参照《中国药典》2020年版四部通则0213蜜炙法制成蜜罂粟壳5批，每100 kg罂粟壳用20 kg炼蜜；以蜜罂粟壳为原料制成的宣肺止嗽合剂，每批蜜罂粟壳制3批合剂，共计15批。

对照品溶液的制备。精密称取吗啡对照品11.88 mg，置于25 mL容量瓶中，加含5%磷酸的20%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀后取1 mL置于25 mL容量瓶中，加入5%磷酸的20%甲醇，制成质量浓度为0.017 991 mg/mL的吗啡对照品溶液。

供试品溶液的制备。精密量取宣肺止嗽合剂样品2 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加含5%磷酸的20%甲醇溶液，密塞，超声处理(功率200 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再继续用含5%磷酸的20%甲醇溶液加至刻度，摇匀，即得。

空白对照溶液的制备。按照处方比例称取除蜜罂粟壳的其他药材适量，依照宣肺止嗽合剂制法制得阴性对照样品，再按“..”方法制得空白对照溶液。

色谱条件。资生堂CAPCELL PAK CMG色谱柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱：0～12 min，3% A→5%A；12～13 min，5% A→20%A；13～18 min，20%A；18～20 min，20% A→3% A；20～23 min，3%A；检测波长210 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃；进样量10 μL。

方法学考察。

线性关系考察。取吗啡对照品溶液适量，加含5%磷酸的20%甲醇溶液配制0.004 448、0.008 896、0.022 240、0.044 480、0.088 960、0.222 394 mg/mL的系列浓度，进样测定，以峰面积为横坐标、浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

精密度试验。取吗啡对照品溶液10 μL(浓度为0.044 480 mg/mL)，重复进样6次，计算吗啡峰面积的RSD。

重复性试验。取同一批宣肺止嗽合剂(编号S-X5-1)平行制备6份供试品溶液，计算吗啡含量的RSD。

稳定性试验。取同一批宣肺止嗽合剂(编号S-X5-1)制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、16、20、24 h进样测定，计算吗啡含量的RSD。

加样回收率试验。采用加样回收法，分别精密量取已知吗啡含量的宣肺止嗽合剂(编号S-X5-1)样品9份，分3组，取样量各为1 mL，精密加入低、中、高(0.5倍、1.0倍、1.5倍)3个浓度的吗啡对照品，按照“..”方法制备供试品溶液，并按“..”色谱条件进行检测，计算加样回收率。

样品测定。按照《中国药典》2020年版一部“罂粟壳”项下含量测定方法测定5批次罂粟壳和蜜罂粟壳中吗啡的含量；再取15批次宣肺止嗽合剂，分别精密量取2 mL，按照“..”方法制备供试品溶液，以“..”色谱条件进行测定，以外标法计算样品中吗啡的含量。

蜜炙系数计算。5批罂粟壳分别以蜜炙法炮制，每100 kg罂粟壳用20 kg炼蜜，平均每批制成约118.5 kg的蜜罂粟壳，则在蜜罂粟壳中的罂粟壳实际占有量为98.75 kg，即蜜罂粟壳中的吗啡含量理论值计算如下：

根据蜜罂粟壳中吗啡含量实测值与理论值差异，计算蜜炙系数，公式如下：

转移率计算。依据蜜罂粟壳及其对应投料生产出的宣肺止嗽合剂中吗啡含量测定结果计算转移率，公式如下：

×100%

2 结果与分析

系统适应性试验。对照品、供试品和空白对照色谱图见图1。图1表明，在“..”色谱条件下，对照品和供试品色谱图中吗啡的保留时间为12 min左右，空白对照色谱图中在该处无其他色谱峰干扰。

图1 对照品(a)、供试品(b)和空白对照(c)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance (a), test substance (b) and blank control (c)

线性关系考察。按“...”方法操作，以峰面积为横坐标、浓度为纵坐标绘制标准曲线，得出吗啡线性方程为=5 671-12 002(=0999 9)，结果表明，吗啡在0.004 448～0.222 394 mg/mL呈良好的线性关系。

精密度试验。按“...”方法操作，测得吗啡峰面积的RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。

重复性试验。按“...”方法操作，测得吗啡含量的RSD为1.2%，表明该方法重复性良好。

稳定性试验。按“...”方法操作，测得吗啡含量的RSD为0.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收率试验。按“...”方法操作，结果见表1，从表1可以看出，平均加样回收率为96.30%，RSD为2.4%，表明该方法回收率良好，可用于宣肺止嗽合剂中吗啡的含量测定。

表1 加样回收率试验结果(n=9)

由表2可知，罂粟壳中吗啡的含量为2.773～3.971 mg/g，蜜罂粟壳中吗啡的含量为2.396～3.917 mg/g，宣肺止嗽合剂中吗啡的含量为0.078～0.128 mg/mL。

表2 罂粟壳、蜜罂粟壳和宣肺止嗽合剂中吗啡含量(n=3)

试验结果显示(表3)，蜜罂粟壳中吗啡含量实测值与理论值存在一定差异，蜜炙系数为0.94～1.23，平均为1.10。

表3 蜜炙系数结果

从表4可以看出，宣肺止嗽合剂中吗啡含量的转移率为53.6%～70.0%，平均转移率为64.2%。

3 结论与讨论

供试品溶液萃取溶剂的优化。药典中宣肺止嗽合剂吗啡含量测定采用酸水-碱化-萃取法处理，即用含5%醋酸的20%甲醇溶液提取。该试验考察了三氯甲烷-氨水、乙酸乙酯-氨水作为萃取溶剂的萃取效果，但考虑到吗啡为两性化合物，在酸性条件下(pH 3～5)较为稳定，故也考察了5%醋酸的20%甲醇、5%磷酸的20%甲醇溶液的提取效果。试验结果表明，碱液的提取率没有明显高于酸溶液，并且在液相谱图上磷酸的试剂峰明显小于乙酸峰，对吗啡的对照峰干扰最低。最终确定试验萃取溶剂为5%磷酸的20%甲醇溶液。

表4 转移率计算结果

供试品提取方式的选择。药典中该试验前处理烦琐、有机溶媒消耗量大、费时且易造成样品中吗啡成分的损失，所以对样品中吗啡进行了多种提取方法的比较研究：方法①加入氨水2 mL，用25 mL乙酸乙酯萃取；方法②直接超声提取法，结果显示，方法②较方法①提取率高、简便易行。故该试验简化了提取方法，使样品的前处理操作简单易行。

提取中因素的比较。参照有关文献，考察供试品溶液取样量、溶剂加入量、超声时间3个因素对宣肺止嗽合剂中吗啡含量测定的影响。在此基础上采用正交试验优化了测定宣肺止嗽合剂中吗啡含量的步骤。试验结果表明，3个因素对吗啡含量的影响程度依次为取样量(A)>溶剂加入量(B)>超声时间(C)；宣肺止嗽合剂中含量最佳的提取条件为取样量2 mL、溶剂加入量10 mL、超声时间30 min。

参照有关文献，考察3种流动相(乙腈-含0.1%甲酸的0.02 mol/L乙酸铵溶液、甲醇-0.1%三乙胺0.02 mol/L乙酸铵、乙腈-0.1%磷酸水)，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃；检测波长为210～250 nm。对测定结果进一步分析发现，当采用乙腈-0.1%磷酸水作为流动相时，检测波长为210 nm，得到较好的峰性和分离度。

根据宣肺止嗽合剂处方量，每1 000 mL制剂含蜜罂粟壳50 g，《中国药典》2020年版一部中规定，罂粟壳和蜜罂粟壳中吗啡含量按干燥品计算应为0.06%～0.40%，则宣肺止嗽合剂中每1 mL吗啡含量理论值应为0.030～0.200 mg。该试验通过考察宣肺止嗽合剂生产工艺，结果显示，罂粟壳经蜜炙后，实际测得吗啡含量高于理论值，即蜜炙系数>1，平均值为1.10；生产过程中，吗啡转移率平均为64.2%。结合以上，推算每1 mL宣肺止嗽合剂中的吗啡含量0.021～0.141 mg/mL。该试验结果显示，15批宣肺止嗽合剂中吗啡含量实际结果在0.078～0.128 mg/mL，平均值为0.105 mg/mL，与推算结果一致。

罂粟壳和蜜罂粟壳以吗啡作为含量测定指标。其吗啡既是有效成分也是有毒成分，久用易于成瘾。故在制定罂粟壳中吗啡的限量标准时，以罂粟壳的处方最大使用量，以及吗啡的每日允许摄入量、平均体重和服用天数进行折算，但是宣肺止嗽合剂中使用的是蜜罂粟壳，所以在限量制定过程中不仅要考虑罂粟壳生产出成品的转移率，也要考虑到罂粟壳经过蜜炙后的转移率。经过对样品测得实际数据与理论数据分析，罂粟壳与蜜罂粟壳有一定的转移系数也就是蜜炙系数。蜜炙系数平均值为1.10，最大值为1.23，也就是说尽管蜜炙罂粟壳经炮炙后占比量少于罂粟壳，但吗啡含量较罂粟壳中增加了。所以将蜜炙系数和转移率这2个因素综合考虑后才能完善宣肺止嗽合剂中吗啡的限量标准制定。