普洱茶挥发性风味物质富集与分析技术研究进展

孙嘉卿，冯 涛，王 凯，庄海宁，宋诗清，姚凌云，孙 敏，王化田

(1.上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418；2.云南中烟工业有限责任公司，云南昆明 6502301；3.上海市城建职业学院，上海 201415)

普洱茶是以云南大叶种晒青毛茶为原料，在地理标志保护范围内采用特定的加工工艺制成，具有独特品质特征的茶叶。主要产自西双版纳、临沧、普洱等地区。按其加工工艺及品质特征，普洱茶分为湿热作用陈化型普洱茶(生茶)，又称为“后发酵茶”和渥堆微生物发酵型普洱茶(熟茶)2种类型。人们对茶叶的嗜好很大程度归结于茶中各类挥发性成分综合作用的结果——茶叶的风味物质。对茶叶风味物质的研究可以直观地反映茶叶的香气特征和不同的茶叶香气之间的差异性。虽然风味物质在茶叶中的含量很少，一般只占干物质的0.01%～0.02%，但对茶叶品质的贡献率达25%～40%，是决定茶叶品质的重要因素。近年来，普洱茶独特的风味及保健功效也使其普及率越来越高，并于2020年入选中欧地理标志首批保护清单。关于其香气活性物质以及形成机理的研究已经成为普洱茶学界研究的热点课题。但从富集分析的角度看来，不同的技术手段对其风味物质的研究影响，尤其是一些新兴的技术手段在普洱茶领域的应用，也需要细致的总结，为普洱茶的生产、质控和新产品的研发提供新的思路。

1 常用的普洱茶风味物质富集技术

同时蒸馏萃取技术(simultaneous distillation and extraction,SDE)由于对中等至高沸点成分的物质具有高萃取回收率，近年来运用广泛，但对于强极性或亲水性成分如酸性、醇溶性成分萃取效率较低。且SDE对样品处理中高温加热次生反应剧烈，会导致原始普洱茶风味的破坏，尤其对一些热敏性香气组分影响较大,且会产生原来样品中没有的、加热产生的后生物，易造成香气物质结构变化；顶空固相微萃取(headspace solidphase microextraction,HS-SPME)与SDE不同，较有利于低沸点的强挥发性成分，尤其是一些酯类物质。不足之处在于萃取纤维头吸附容量有限，对挥发性成分的选择性吸附易导致数据分析中香气组成比例失衡，难以进行定量分析。溶剂辅助风味蒸发技术(solvent assisted flavor evaporation,SAFE)的优势在于可以萃取出较大比例的极性挥发性物质，香气较为自然逼真。低真空度及低冷凝温度控制能够对茶叶挥发性组分中低沸点的萜烯类香气、热敏性成分、在高温下易降解的较高沸点的酯类香气起到较好的保护作用，能对难挥发成分进行分离剔除，对含有多种不挥发成分且易发生凝聚的茶汤基质具有较好的香气分离效果，有利于醇类、脂肪酸类化合物的提取，但相对装置和清洗较为复杂。表1列举了一些已有富集方法和特征香气成分的结果。

由表1可知，采用目前常用的富集技术得到的普洱熟茶中杂氧化合物含量较高，生茶中的杂氧化合物含量极低，芳樟醇及其氧化物的含量相对较高。由于茶叶风味物质含量低微，组成复杂，且在提取过程中易发生氧化、聚合、缩合、基团转移等复杂的化学反应，所以各种提取方法的定性定量结果有一定的差别，不同香气提取方法均存在一定缺陷，有待开发灵敏度更高，次生反应更小的方法以全面了解普洱茶中的香气成分。其次，可能由于成本较高，对于普洱茶风味的提取分析，已发表的研究均只应用SDE或HS-SPME等进行了一次提取分析，较少关注重现性，后面的研究中可尝试多次试验提高准确性。

表1 不同富集方法及检测技术鉴定普洱茶特征香气成分

2 较有前景的新兴富集技术

旋转锥体柱蒸馏技术作为一种高效独特的液-气接触蒸馏技术，主要是通过真空度降低物料沸点，以较低的温度分离不同沸点的物质。具有提取效率高、蒸馏时间短、产物香气逼真的优点，并且可灵活控制萃取的香味物质的组成及特性，温度可调节，方便清洗。近年来主要运用在低醇以及无醇饮料的制备。已经逐渐受到天然植物香料领域的关注。高阳等首次使用该技术对龙井茶挥发油进行了提取，并和传统的水蒸气蒸馏技术制备的挥发油在得率、香气成分、加香效果等方面进行了对比分析，发现SCC挥发油得率和鉴定出香气成分均高于传统的水蒸气蒸馏法，且香气更加自然、逼真。在卷烟加香评吸结果中发现，SCC挥发油能够增加清新自然的茶香气息，具有丰满香气、细腻柔和烟气、改善余味的功效，能够较好地提升卷烟的抽吸品质，说明该技术在茶香香原料制备方面具有一定的优势和应用价值。目前虽暂未有采用该技术关于普洱茶的研究，但作为一项全新的蒸馏技术，随着其理论技术的日益发展与完善，尤其在挥发性香气物质分离领域，会成为最有优势的商业化分离纯化技术之一。其流动模式见图1。

吹扫捕集技术是通过一定时间的吹扫，富集挥发性香气成分，通常与热脱附解吸相连，是利用热脱附系统将萃取到的物质进行热脱附，然后通过GC-MS进行挥发性香气成分的分离定性。具有操作简单、灵敏度高和无需有机溶剂的特点。主要针对进行低至ppb级的微量挥发性组分所具有的高度富集作用和定量重现的特征测定，工作示意图见图2。蔡泳龙等对乌龙茶进行P&T-TD分析并得到关键呈香物质；杨环等采用P&T-TD提取2种不同香型凤凰单丛茶的香气成分，发现P&T-TD法提取得到的成分种类多，不同香型的茶区别较大。张铭光等采用热脱附-裂解色谱法测定不同制作工艺、不同存储时间、不同存放地点的普洱茶色谱指纹图谱，虽然植物成分受到破坏，但不同的植物都有其特有的裂解指纹信息，同时有些挥发组分可通过热脱附解吸，获得了更丰富的指纹信息。说明P&T-TD法作为一种新的天然产物挥发性物质分析时的富集方法有很大的运用空间。

图1 SCC中抽气和进料液的流动模式Fig.1 Flow patterns of suction and feed liquid in SCC

图2 吹扫捕集工作示意Fig.2 Schematic diagram of purging and trapping

ICECLES可以被看做是冷冻浓缩(freeze concentration,FC)和搅拌棒吸附(stir bar sorpyive extraction,SBSE)的结合，作为固相微萃取的改进，适用于浓缩水性样品中的挥发性成分，萃取过程如图3所示。主要有顶空吸附、浸入吸附和浸入顶空混合吸附3种采样方法，吸附的物质可用于溶剂洗脱解吸，也可在热脱附装置上进行热解析，但更好地实现了痕量、超痕量物质以及极性和更易挥发或热稳定差物质的富集。Alluhayb等采用该技术对绿茶饮料风味物质进行富集，比SBSE多得到56种物质，显示出其较强的风味富集能力。该技术虽暂无在普洱茶领域的应用，但也表明有很好的前景。

3 目前常用的普洱茶风味分析技术

气相色谱和液相色谱作为风味分析最为主要的手段，已被广泛应用，该研究主要对以下几种分析技术进行论述。

图3 ICECLES的样品萃取过程Fig.3 Sample extraction process of ICECLES

E-nose作为一种区别于气相色谱、气质联用等仪器，是通过气体传感器的相应图谱识别样品的挥发性香气成分，并应用数据处理系统对样品整体挥发性香气成分进行分析和评价，其给出的不是被测样品中某种或某几种成分的定性定量结果，而是样品气味的整体信息，也称“指纹”数据。具有检测范围广、速度快、前处理简单方便等优点，在气味识别方面有独特的优势，目前已被广泛应用于普洱茶等级、品种的区分研究中(表2)。

由表2可见，近年来PEN3电子鼻由于其MOS传感器阵列敏感度高，响应快(<10 s)且传感器个数较多(10个)运用最为广泛。但电子鼻技术仍存在一些不足，如传感器会受环

表2 不同型号电子鼻在普洱茶风味领域的应用

境温湿度等影响，存在随时间漂移的现象。特征变量的选取以及不同的数据处理方法对研究结果会产生影响，只有当电子鼻与其他分析仪器的数据融合分析，数据筛选与处理的研究更加多元化、准确化、规范化，电子鼻才能在普洱茶研究中向着实用化的方向不断发展，才可实现更加全方位、多角度的检测。

GC-O是利用人的鼻子嗅闻经气相色谱柱分离后的各个馏分，以检测香味样品的气味组成的方法。嗅闻后与检测器鉴定的化学成分对应，对挥发性成分进行描述分析。GC-O在普洱茶领域的应用见表3，可见GC-O在对风味物质香气分路的归类方面应用较广，能够鉴定出普洱茶主要的风味特征以及对应的风味物质，且相比AEDA稀释法和DF检测频率法，主要的检测方法为时间强度法。

表3 GC-O在普洱茶风味领域的应用

4 新兴分析技术

现已有研究将 GC-IMS用在鉴别咖啡豆，快速识别蜂蜜、橄榄油等的不同产地、品种、等级，以及在线监测鉴别绿茶、新会柑普茶(新会茶枝柑和普洱茶结合)风味变化，实现了“风味看得见”。该技术结合GC的突出分离特点进行定量分析和离子迁移谱仪的高灵敏度、快速响应，具有大气压及室温下即可进行定性分析的优势，有很大的发展空间。同时若能进一步完善 GC-IMS 的数据库的 VOCs 信息，并将分析结果与化学计量学方法结合，则更有利于探明不同种类所研究物质的活性化合物。但尚未有针对普洱茶的相关研究文献。IMS工作原理见图4。

图4 IMS工作原理Fig.4 Working principle of IMS

原位电离质谱技术是结合原位离子化技术与质谱技术，在敞开式环境下进行快速离子化的一类质谱分析技术。由于其前处理简单，以及绿色环保、快速、无损检测等特点也越来越多地被应用于食品、药物研究、临床研究、组学、环境物质、化学品研究等领域。其中实时直接分析(direct analysis in real time，DART)尤其具有实时、超快、耐盐、兼容机制、广谱的特征。在茶叶领域，张丽等就利用此方法与质谱结合对不同产地和不同级别的碧螺春红茶进行分析，发现茉莉内酯、百里香酚、柠檬烯等为其特征香气成分。Prchalová 等对草药茶(含茴香、甘菊、荨麻、椴树、薄荷、百里香等)中特征化合物如糖苷、黄酮类化合物、酚类和萜类物质进行了分析研究。在普洱茶领域也可以利用此技术进行分析鉴定其特征化合物，原位质谱离子化范围见图5。

风味轮是将茶叶的风味用专业描述语按类型整理成圆盘形状(图6)。李向波等首次将普洱茶风味轮的绘制应用于茶叶感官分析；张颖彬等基于中国茶叶感官审评术语基元语素建立的中国茶叶风味轮，为茶叶感官特征的定性定量研究提供了较为全面和系统的描述语体系。若能在2者基础上建立考察不同产地、等级、工艺特征、贮藏发酵条件等各类影响因素的专属普洱茶的风味轮，将会在普洱茶感官评价角度提供更为全面客观的评价，弥补普通感官评价准确性的缺乏，使感官评价和交流有可靠的依据，有助于产品质量控制、不同风味形成机理的研究、辨析茶叶区分优劣。

图5 原位质谱离子化范围Fig.5 Ionization range of in situ mass spectrometry

图6 拟建立的普洱茶风味轮Fig.6 Flavor wheel of Pu’er tea to be established

5 结语

随着新兴技术的发展，对普洱茶风味物质的研究将越来越深入。未来的研究中应抓住不同富集方法和分析技术的优缺点，针对普洱茶风味物质的特性，最大效能地发挥普洱茶中不同特征风味物质在不同领域的应用。同时积极拓宽普洱茶的应用领域和产业链。通过普洱茶与烟草、中医药等方面的结合以及芳香疗法等发挥普洱茶香气更大的作用。