基于网络药理学研究黄芪治疗逼尿肌无力的作用机制

张昌鋆，程义东，朱晓雨，陶方泽，王安喜

(南京中医药大学附属南京中医院，江苏 南京 210001)

黄芪是豆科黄耆属植物。在泌尿系统中具有利尿、抑菌及类激素样等作用。膀胱逼尿肌在人排尿时可以产生强有力的收缩，使膀胱内压力急速升高以完成排尿。所以膀胱逼尿肌无力时可发生排尿障碍。在中药方剂中黄芪对于改善膀胱逼尿肌无力导致的排尿障碍有着独特的作用。

网络药理学技术通过构建药物、成分、靶点、疾病、通路之间的复杂网络来预测药物的作用机制，适用于中药复杂体系机制分析[1]。本文对黄芪治疗膀胱逼尿肌无力开展网络药理学分析，研究黄芪治疗膀胱逼尿肌无力的药效基础、潜在靶点以及作用通路，以期为黄芪治疗膀胱逼尿肌无力的作用机制提供更多理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

应用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis platform，TCMSP)寻找黄芪化学成分，筛选口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且类药性(drug likeness，DL)≥0.18[2]的有效成分，获得黄芪的有效成分。同样从TCMSP中挖掘出黄芪有效成分所作用的蛋白质靶点。并且运用perl脚本，结合UniProt数据库对黄芪的作用靶点进行基因注释。

1.2 方法

1.2.1 疾病相关靶点的筛选 GeneCards数据库包含治疗各种疾病相关的蛋白质的靶点和基因。本研究基于GeneCards数据库筛选膀胱逼尿肌无力相关靶点。将上述疾病靶点与黄芪潜在靶点取交集，共收集到17个基因，作为疾病和药物的共同潜在靶点。

1.2.2 构建蛋白质互作(protein-protein interaction,PPI)网络 对黄芪治疗膀胱逼尿肌无力的作用靶点进行相应的PPI网络分析。借助STRING数据库对筛选出的靶点进行PPI网络分析。

1.2.3 构建中药-有效成分-靶点网络图 依据黄芪药物有效成分与膀胱逼尿肌无力靶点之间相互作用关系，运用Cytoscape软件将复杂的网络关系进行可视化处理。

1.2.4 靶点的GO与KEGG富集分析 为了进一步研究筛选出的黄芪作用靶点的潜在生物学效应，运用R软件对疾病与药物交集靶点进行GO生物学过程富集分析和KEGG通路注释分析。

2 结果

2.1 有效成分的预测

依据TCMSP数据库，在OB≥30%、DL≥0.18 的筛选条件下，剔除没有靶点的化合物，从黄芪中共挖掘出11个有效成分(表1)以及80个对应靶点基因。

表1 黄芪潜在有效成分

2.2 疾病相关靶点的获取

基于GeneCards数据库，对膀胱逼尿肌无力相关靶点进行挖掘，共挖掘出188个与膀胱逼尿肌无力相关的靶点。将上述二者靶点取交集，共得到17个靶点基因用于后续分析。

2.3 PPI网络的构建

将取交集得到的17个靶点导入STRING数据库进行PPI分析，得出PPI网络图(图1)，再利用R软件包绘制出柱状图(图2)。

图1 蛋白质互作网络图

图2 蛋白质互作柱状图

2.4 构建中药-有效成分-靶点网络图

为了更好地体现中药-有效成分-靶点之间的网络关系，借助Cytoscape软件将复杂的网络关系进行可视化处理(图3)。

黄色节点代表药物，紫色节点代表疾病；11个青色节点代表药物的有效成分，17个红色节点代表作用靶点。图3 中药-有效成分-靶点网络关系图

2.5 GO和KEGG富集分析

处理软件采用R软件。GO富集分析结果显示上述靶点分别参与了G蛋白偶联胺受体活性、乙酰胆碱受体活性等生物进程(图4)。KEGG通路富集分析(图5)显示靶点显著富集于钙信号通路(图6)、PI3K-Akt信号通路(图7)等多种途径。

图4 GO富集分析气泡图

图5 KEGG通路富集分析气泡图

图6 钙信号通路图

图7 PI3K-Akt信号通路图

3 讨论

膀胱逼尿肌是膀胱壁肌层的主要组成部分，由平滑肌纤维构成，膀胱逼尿肌收缩，可使膀胱内压升高，压迫尿液由尿道排出，完整的膀胱逼尿肌功能是排空膀胱的基础。所以膀胱逼尿肌无力可严重影响正常的排尿功能。目前市场上还没有明确针对膀胱逼尿肌无力进行治疗的中药，但黄芪对膀胱逼尿肌无力有改善作用。黄芪在泌尿科应用广泛且疗效显著[3]，黄芪及其有效成分和含黄芪经方可以通过多个靶点和机制保护肾脏[4]，黄芪也在排石方面发挥重要作用[5]。这为探索黄芪治疗膀胱逼尿肌无力提供了理论基础以及临床经验。

关于黄芪对膀胱逼尿肌无力的改善作用，不仅有动物实验，也有临床经验。关于动物实验，罗孟雄等[6]发现黄芪提取物能增加前列腺增生模型大鼠膀胱逼尿肌的收缩强度。钱乐等[7]发现黄芪水提液能够降低老年大鼠膀胱逼尿肌纤维化程度。另有动物实验[8]证实黄芪为君药，能显著兴奋大鼠的膀胱逼尿肌，并且已经有量化数据，其中以云南省中医医院泌尿男科研制的以黄芪为君药的前列通窍胶囊疗效最为显著[9]。黄芪不仅可以显著缩短大鼠膀胱逼尿肌细胞周期，也能在一定程度上改善大鼠膀胱逼尿肌组织形态，而且还能提高大鼠膀胱逼尿肌细胞凋亡调控基因表达，从而促进膀胱逼尿肌细胞凋亡，抑制膀胱逼尿肌的病理增生。为什么要抑制膀胱逼尿肌的增生？有学者认为膀胱梗阻后膀胱逼尿肌细胞线粒体水肿明显，密度下降，提示膀胱逼尿肌细胞能量代谢障碍，导致其收缩功能下降，这就是为什么良性前列腺增生患者引起膀胱壁肥厚而其收缩功能明显降低的原因。膀胱逼尿肌的收缩功能同时还受到其他相关因素的影响，如生长因子、神经递质等，具体的作用机制有待深入研究。

临床上也有黄芪对膀胱逼尿肌无力的疗效观察：许正国等[10]认为黄芪能加强膀胱逼尿肌收缩；张春和等[11]以黄芪作为君药治疗前列腺增生膀胱逼尿肌无力；张国用等[12-14]研究发现黄芪通过降压、清除氧自由基对泌尿系统产生影响。而本文对于探索黄芪治疗膀胱逼尿肌无力进行了专门的作用机制研究，以下就对本研究进行详细阐述。

在阐明中药复方的作用方式中，网络药理学提供了清晰有效的思路[15]。本研究运用TCMSP 数据库筛选出11个黄芪潜在有效成分。根据本研究预测结果，白介素-6(interleukin-6，IL-6)、雄激素受体、细胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)、酪氨酸激酶受体2等是黄芪改善膀胱逼尿肌无力的主要作用靶点。IL-6是一种炎症因子，梁可等[16]研究发现黄芪皂苷能提高化疗贫血模型小鼠血清中IL-2、IL-4的含量，降低IL-6的含量。黄芪皂苷能够改善环磷酰胺所致的小鼠免疫力低下和骨髓抑制情况。这提示炎症反应可能参与膀胱逼尿肌无力的发生过程。雄激素受体主要位于睾丸间质细胞和支持细胞的细胞核内，而泌尿系统与生殖系统在胚胎发育中源，故雄激素对膀胱有重要影响。张勇[17]研究证实剥夺雄激素会改变和损伤大鼠膀胱平滑肌超微结构，从而导致膀胱纤维化。

在GO 功能富集化分析中得到黄芪改善膀胱逼尿肌无力主要的生物过程包括G蛋白偶联的胺受体活性、乙酰胆碱受体活性等。对于乙酰胆碱在黄芪与膀胱逼尿肌中的关系[18]，支配膀胱逼尿肌的神经主要为胆碱能神经，该神经通过副交感神经节后纤维释放的乙酰胆碱作用于膀胱逼尿肌内M受体发挥作用。M受体在膀胱逼尿肌中含量最高，尤以膀胱体部含量最高，其含有多种亚型，主要为M2和M3受体。乙酰胆碱通过 M3 受体直接介导膀胱逼尿肌的收缩，而M2受体不能直接作用于膀胱逼尿肌，需要通过抑制乙酰环化酶，进而抑制β受体调节的松弛作用而达到间接介导膀胱逼尿肌收缩。黄芪正是通过影响乙酰胆碱受体活性这一生物过程来改善膀胱逼尿肌无力的。李虎虎等[19]研究发现黄芪注射液对糖尿病大鼠血清乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AchE)活力有影响，与空白组进行比较，模型组大鼠血清AchE 活力明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，黄芪注射液干预后，黄芪注射液组与模型组大鼠相比较，AchE活力明显下降，差异有统计学意义(P<0.05) 。

徐鹏等[20]研究发现中药(含黄芪)可以降低血清乙酰胆碱受体抗体(acetylcholine receptor antibody, AchR-Ab)表达水平，其分析了12 篇文献，报道了血清 AchR-Ab变化，meta分析结果显示：中药组(含黄芪)较模型组可以明显降低血清 AchR-Ab 水平 (P<0.001)。许梦贤[21]研究发现黄芪高剂量组疗效最好，可明显减少血清中AchR-Ab的含量。

对于CCND1来说，郭超等[22]研究发现黄芪注射液可下调CCND蛋白表达水平。张淳等[23]研究发现黄芪对CCND1具有一定的改善作用。KEGG 通路富集分析结果表明钙信号通路、PI3K-Akt信号通路等是黄芪改善膀胱逼尿肌无力的重要信号通路。对于钙信号通路的研究，蔺美玲等[24]研究证实黄芪可能激动L-电压依赖性钙通道增加膀胱逼尿肌肌条张力。张春和等[25]研究证实以炙黄芪为主的前列冲剂对膀胱逼尿肌的兴奋作用与L型钙通道有联系。尤其是SUI等[26]研究报道在人类膀胱逼尿肌细胞中有L型和T型Ca2+通道的存在。在L型Ca2+通道方面，膀胱功能的改变与膀胱逼尿肌细胞特有成分的分子生理学上的变化相对应[27]。在人类正常膀胱逼尿肌细胞中亦发现存在T型Ca2+电流[28]。邓建平[29]研究发现T型Ca2+通道参与调控膀胱逼尿肌兴奋收缩。

对于PI3K-Akt信号通路，吴金梅等[30]研究认为黄芪可以激活PI3K/Akt信号通路，促进肌肉摄取葡萄糖。张瓅方等[31]研究发现黄芪丹参配伍提取物在心肌梗死大鼠模型中可上调PI3K-Akt信号通路表达。王雪林等[32]研究发现黄芪多糖可能通过抑制PI3K/Akt信号通路发挥自噬抑制作用。马可可[33]研究发现黄芪甲苷可能通过调控PI3K/Akt/FoxO1信号通路从而保护肾组织。朴芮仙[34]研究发现高浓度黄芪含药血清可以抑制由脂多糖刺激而激活的PI3K-Akt蛋白表达，进一步抑制下游炎症因子。这说明黄芪对于PI3K/Akt信号通路的影响是多方面的，不仅仅局限于膀胱逼尿肌和泌尿系统方面，关于其他方面的影响还有待深入研究。综上所述，详细讨论了几个主要的生物过程和几条主要的信号通路，也通过讨论突出了黄芪改善膀胱逼尿肌无力的多靶点、多通路的作用特点。

本研究一方面通过运用网络药理学方法探析了黄芪改善膀胱逼尿肌无力的作用机制，分析结果显示的靶点和作用通路与目前的临床和文献资料实验相互补充；另一方面，本研究突出黄芪改善膀胱逼尿肌无力可能的多靶点、多通路的作用特点，为后续研究治疗膀胱逼尿肌无力提供了参考思路。