高效液相色谱法测定复方鱼肝油氧化锌软膏中呋喃西林含量*

苗会娟，徐艳梅，王春霞，盖 成，高燕霞

（河北省药品医疗器械检验研究院·国家药品监督管理局仿制药质量控制与评价重点实验室，河北 石家庄 050200）

复方鱼肝油氧化锌软膏又名复方氧化锌鱼肝油软膏，为皮肤科非处方药。其是由鱼肝油、呋喃西林、氧化锌、石蜡等制成的复方脂溶性软膏，主要用于治疗急慢性皮炎、冻疮、轻度烧伤等［1-4］。呋喃西林属防腐消毒药，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及大肠杆菌等有较好抗菌作用［5］。复方鱼肝油氧化锌软膏现行质量标准收载于《国家药品标准·化学药品地方标准上升国家标准（第六册）》［WS1-43（B）-89］，其中缺少呋喃西林含量控制项，给药品质量控制、市场监管、医院和患者用药产生了不可预知的影响。为保证用药安全，本研究中建立了测定呋喃西林含量的高效液相色谱（HPLC）法，并按人用药物注册技术要求国际协调会（ICH）标准［6］进行验证，旨在为复方鱼肝油氧化锌软膏的质量控制和监督提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo U3000型高效液相色谱仪，包括DAD检测器（美国Thermo Fisher公司）；XS105型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为十万分之一）；PB-20型pH计（德国Sartorius公司，精度为0.01 pH）；Memmert D91126型恒温水浴振荡器（德国Memert公司，准确度为0.1℃）。

1.2 试药

复方鱼肝油氧化锌软膏（天津市金耀药业有限公司，批号分别为19030401，19030402，19030403，规格为每1 g中含呋喃西林1 mg）；呋喃西林对照品（中国食品药品检定研究院，批号为101167-201001，含量99.4%）。三乙胺、乙腈均为色谱纯，冰醋酸为优级纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welch Xltimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.2%三乙胺溶液（冰醋酸调pH至4.0）-乙腈（80∶20，V/V），检测波长：375 nm，柱温：30℃；进样量：20 μL［7］。

2.2 溶液制备

取呋喃西林对照品约10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺1 mL使溶解并定容，摇匀，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，即得呋喃西林质量浓度约为10 μg/mL的对照品溶液。取样品约1 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，加水适量，置80℃水浴中剧烈振摇15 min使溶解，冷却至室温，全部转移至100 mL容量瓶中，用水定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按复方鱼肝油氧化锌软膏处方工艺制备缺呋喃西林的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备，即得阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验及专属性考察：精密吸取2.2项下3种溶液各20 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱峰，详见图1。可见，阴性对照无干扰，理论板数按呋喃西林峰计均大于3 000，分离度均大于1.5，基线分离良好。

图1 高效液相色谱图1.NitrofurazoneA．Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：取呋喃西林对照品约10.60 mg，精密称定，按2.2项下方法制备质量浓度为106.00 μg/mL的对照品贮备液，用水逐级稀释，得呋喃西林质量浓度分别为0.50，1.06，4.24，10.60，50.30，106.00 μg/mL的系列对照品溶液。按2.1项下色谱条件进样测定，以对照品溶液质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=0.837 5X-0.756 5（r=0.998 7，n=6）。结果表明，呋喃西林质量浓度在0.50～106.00 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

定量限及检测限考察：往阴性样品中添加对照品溶液，作为检测供试品，按2.2项下方法制备供试品溶液，注入液相色谱仪，计算信噪比（S/N），分别以S/N为3和10时的质量浓度作为检测限及定量限。结果检测限为0.1 μg/mL，定量限为0.3 μg/mL。

精密度试验：取2.2项下对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果的RSD为0.48%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2项下供试品溶液（批号为19030403）适量，分别于室温下放置0，2，4，8，12，22，24 h后，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为1.21%（n=7），表明室温下供试品溶液放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（批号为19030403）适量，按2.2项下方法平行制备供试品溶液6份，再按2.1项下色谱条件连续测定6次，记录峰面积并计算含量。结果平均含量的RSD为0.96%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：称取已知含量样品（批号为19030403，呋喃西林含量为0.90 mg/g）6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入呋喃西林对照品溶液（106.0 μg/mL）8 mL混匀，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 样品含量测定

取3批样品（批号分别为19030401，19030402，19030403）内容物，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品含量。结果3批样品中呋喃西林含量分别为86.34，89.62，84.67 mg/g，平均86.88 mg/g。

3 讨论

预试验中，对对照品溶液和供试品溶液进行了全波长扫描，结果最大波长为375 nm，峰纯度大于99%。取供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样，考察不同色谱柱［Agilent ZORABAX C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）及Welch Xltimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］，以不同液相色谱仪（日本Shimadzu LC-20A型、美国Agilent 1260型及美国Thermo Fisher U3000型）测定，结果均能满足系统适用性要求。流动相先后考察了乙腈-30 mmoL/L磷酸氢二钠溶液（含0.1%三乙胺，50%磷酸调pH为3.0）（18∶82，V/V）［8］，甲醇-水（60∶40，V/V）［9］、甲醇-0.05 mol/L磷酸氢二钠（pH 7.0，30∶70，V/V）［10］、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢铵（pH 4.5，20∶80，V/V）［11］及0.2%三乙胺溶液（冰醋酸调pH至4.0）-乙腈（80∶20，V/V），发现加入三乙胺可减少呋喃西林色谱峰的拖尾，改善峰形，且该pH为4.0的条件下，与相邻峰的分离度最好，且不含无机盐，配制简单，因此，选定0.2%三乙胺溶液（冰醋酸调pH至4.0）-乙腈（80∶20，V/V）作为流动相。

复方鱼肝油氧化锌软膏为多组分化学药，基质为无水羊毛脂和凡士林，为脂溶性基质，因此呋喃西林的提取要综合考虑基质和其本身溶解性。呋喃西林在乙醇中微溶，在水中极微溶解，而无水羊毛脂和凡士林难溶于水和乙醇。根据这一差异，考察了乙醇、水作为提取的效果，结果显示，两者的测定结果和回收率基本一致。综合考虑环保和经济性等因素，选用水作为提取溶剂，同时依据正交试验原理［12-15］，考察了水浴温度、提取时间和锥形瓶体积等因素对提取结果的影响，结果显示，置100 mL锥形瓶中，80℃水浴加热15 min的条件最佳。综上所述，本研究中建立的方法分离效果和重复性均良好，测定结果准确，回收率高，可用于复方鱼肝油氧化锌软膏中呋喃西林的含量测定。