灵芝超微粉高效液相色谱特征指纹图谱研究*

吴长辉

（药用菌栽培与深加工国家地方联合工程研发中心·福建仙芝楼生物科技有限公司，福建 福州 350001）

灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝Ganoderma sinenseZhao.Xu et Zhang的干燥子实体［1］。药理学研究表明，灵芝具有调节免疫、保肝、抗肿瘤、抗衰老、提高机体耐缺氧能力等活性［2］。灵芝传统用法为切厚片［3］，以水煎煮后服用，由于其纤维性强，水溶性浸出物仅约4%，有效成分利用率低。为提高灵芝的利用率，可将其制成300目的超微粉［4］，但灵芝经超微粉碎后，原有性状被破坏，建立有效的鉴别方法尤其重要。中药特征图谱为多指标质量控制模式，可较全面地反映化学成分的种类和数量，从而较全面、综合地体现中药质量［5］，其中以高效液相色谱（HPLC）法应用较广［6］。灵芝含丰富的三萜类成分，特征较明显［7-8］。故本研究中建立了灵芝超微粉的HPLC特征指纹图谱，以为其质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

R205型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；UV2450型紫外-可见分光光度计、LC20A型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；TDL-40B型离心机（上海安亭科学仪器有限公司）；XS05型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为十万分之一）；SK1200型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试药

灵芝超微粉（福建仙芝楼生物科技有限公司，批号见表1）；灵芝酸A对照品（中国食品药品检定研究院，批号为F6MX-ZHS2，含量≥95.0%）；灵芝酸C2对照品（批号为160305，含量≥98.0%）、灵芝酸F对照品（批号为160308，含量≥98.0%），均购自中国医学科学院药物研究所；乙腈、甲醇均为色谱纯，乙酸乙酯、甲酸均为分析纯，水为纯化水。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-乙腈（B）-0.04%甲酸水溶液（C），梯度洗脱（洗脱程序见表2）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：40℃；进样量：20 μL。

表2 流动相梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution procedure of mobile phase

2.2 溶液制备

取灵芝酸A，C2，F对照品各5 mg，精密称定，分别加甲醇溶解并定容至10 mL；分别取1 mL，置10 mL容量瓶中，加用甲醇定容，摇匀，即得对照品溶液。取样品约1 g，精密称定，加乙酸乙酯50 mL，超声（功率50 W，频率53 Hz）提取30 min，滤过、蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验：取样品（编号为S11）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，以灵芝酸A峰为参照峰，计算主成分峰的相对保留时间及相对峰面积。结果主成分峰相对保留时间的RSD均小于0.4%，相对峰面积的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取2.2项下供试品溶液（编号为S11）适量，分别于室温下放置0，2，4，8，12，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，以灵芝酸A峰为参照峰，计算主成分峰的相对保留时间及相对峰面积。结果主成分峰相对保留时间的RSD均小于0.1%，主成分峰相对峰面积的RSD均小于3.0%（n=6），表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（编号为S11）适量，共6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定。以灵芝酸A峰为参照峰，计算主成分峰的相对保留时间及相对峰面积。结果主成分峰相对保留时间的RSD均小于0.3%，主成分峰相对峰面积的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立与相似度评价

指纹图谱建立：取11批样品各适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，将11批样品的HPLC数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版），得11批样品的HPLC叠加指纹图谱（图1），设S1样品图谱为参照，其他样品色谱峰与参照图谱进行自动匹配，即得样品共有模式的对照指纹图谱（图2），结果共确定11个共有峰。通过与对照品图谱（图3）的比对，确认2号峰为灵芝酸C2，6号峰为灵芝酸A，9号峰为灵芝酸F。共有峰的相对保留时间及相对峰面积见表3、表4。

表3 11批样品高效液相色谱图共有峰相对保留时间Tab.3 Relative retention time of HPLC common peaks of 11 batches of samples

表4 11批样品高效液相色谱图共有峰的相对峰面积Tab.4 Relative peak areas of HPLC common peaks of 11 batches of samples

图1 11批样品高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 HPLC superimposed fingerprinst of 11 batches of samples

图2 样品高效液相色谱对照指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints of samples

图3 对照品高效液相色谱图2.Ganoderic acid C2 6.Ganoderic acid A 9.Ganoderic acid FFig.3 HPLC chromatograms of reference substances

相似度评价：以共有模式为对照图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版本）软件计算11批样品的相似度。结果相似度均大于0.94，详见表5。

表5 11批样品相似度评价结果Tab.5 Similarity evaluation results of 11 batches of samples

3 讨论

预试验中比较了甲醇、乙醇和乙酸乙酯做提取溶剂时对结果的影响。结果采用前两种溶剂提取时，供试品溶液色谱图中前15 min的杂峰较多，而用乙酸乙酯提取的效果较好。因柱温对分离效果影响较大［9-11］，预试验中对35℃和40℃柱温进行了对比研究，采用35℃时，色谱图中25～40 min之间的色谱峰分离较差，而40℃时，各个色谱峰分离效果相对较好。对供试品溶液进行190～800 nm全波长扫描［12-13］，多数成分在254 nm波长处有较大吸收，主要色谱峰分离较好，且基线平稳。

灵芝三萜酸类物质的检测分析，流动相主要为甲醇、乙腈、甲酸水溶液等［4，14-15］，预试验中考察了甲醇-0.04%甲酸水溶液、乙腈-0.04%甲酸水溶液、甲醇-乙腈-0.04%甲酸水溶液作为流动相，分别按不同的洗脱程序进行洗脱。结果甲醇-乙腈-0.04%甲酸水溶液三元梯度洗脱的效果较好。

本研究中收集了11个批次的灵芝超微粉，采用HPLC法进行了特征指纹图谱研究。由色谱图可见，各批次样品的色谱图整体具有一定的相似性，主成分峰特征基本一致，相对保留时间的RSD值均小于2.0%。由相对峰面积计算结果可见，部分色谱峰的相对峰面积差异较大，表明所含成分含量差异较大。

综上所述，本研究中所建HPLC指纹图谱可为灵芝超微粉的真伪鉴别和质量评价提供参考。