载锌凹凸棒石对犬免疫、抗氧化和抗运输应激能力的影响

2022-10-12罗有文袁华根

动物营养学报 2022年9期

罗有文郑丹曹斌袁华根曹云李雪

(1.江苏农牧科技职业学院，泰州225300；2.南京师范大学泰州学院，泰州225300)

应激是机体对外界或内部的各种刺激所产生的非特异性应答的总和[1]。运输应激是动物产生应激的重要因素，据报道，运输会降低动物的抗氧化能力，抑制免疫系统，引起机体代谢产生变化[2-4]，甚至导致动物组织器官受到严重损伤[5-6]，并影响应激反应相关基因如B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、热休克蛋白(HSP)的表达[7-8]，对犬血液生化指标和皮质醇含量均有明显影响[9]。运输应激受许多因素的影响，如温度、噪声、饲养密度、运输距离、身体接触等[10]。目前，维生素、氨基酸、生物多糖、电解质及矿物元素等可应用于饲粮或饲料添加剂中，以降低动物的应激反应，增强其抗应激能力[11]。

锌是犬的必需微量矿物元素之一，在犬的生理代谢中起着重要的作用，如参与细胞分裂、有机物代谢，刺激免疫器官发育，维持免疫功能发挥等[12]。锌也是体内许多酶的成分和激活剂，参与体内小分子蛋白如生长转录因子、受体、细胞因子等的生成，并维持动物的正常抗氧化系统[13]。锌对犬的生长、免疫、抗氧化和肠道菌群有明显的影响[9,14]。长期以来，为提高生产性能，动物饲粮中一般会添加较高剂量的锌[15]，未被利用的锌随粪尿排出体外。犬饲粮中一般以硫酸锌(ZnSO4)的形式满足犬对锌的需要，研究发现，锌、铜的生物学利用率主要受添加物形式等因素的影响[16]，螯合锌或有机锌可以改善动物健康状况，提高锌的利用率[17]，减少粪便中锌的排泄[18-19]，降低运输应激反应[20]。氨基酸锌可以提高犬对饲粮中干物质的表观消化率，改善犬的生长性能[21]、被毛品质和免疫功能等[22]。

凹凸棒石黏土(Pal，简称凹土)是一种由八面体层状镁铝硅酸盐组成的纤维状非金属黏土矿，具有纳米通道结构，结构中包含水和可交换离子[23]，由于特殊的纳米显微结构而具有较大的比表面积，表现出较强的吸附性和离子交换性，常作为微量营养素或药物缓释剂的载体[24-25]。载锌凹凸棒石黏土(Zn-Pal，简称载锌凹土)可以通过离子交换法进行制备。研究发现，用离子交换法制得的Zn-Pal可以提高肉鸡肝脏、肌肉中抗氧化酶活性和血清免疫功能，并可作为饲粮中锌的良好来源[24,26]。然后，饲粮Zn-Pal对犬的抗氧化、抗应激作用以及犬对Zn-Pal的利用率是否优于ZnSO4却鲜见报道。目前对抗运输应激的研究基本停留在猪、鸡、鱼等动物上，对犬的研究较少。近年来，为满足犬作为实验动物、伴侣动物的需要，运输已成为不可或缺的一部分。本试验以比格犬(Beagle dogs)为试验对象，探讨Zn-Pal对犬免疫、抗氧化和抗运输应激能力的影响，以期为Zn-Pal作为犬饲粮锌来源提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用凹凸棒石黏土由江苏某生物科技股份有限公司提供。Zn-Pal参照Zhang等[27]方法进行制备，制备后的Zn-Pal经硝酸(HNO3)溶解处理后用等离子体质谱仪(ICP-MS，Xseries 2)测定锌负载量。经测定，Zn-Pal中所负载的锌量为23.57 mg/g。

1.2 试验设计与基础饲粮

选取10月龄健康比格犬20只，公母各占1/2，体重相近，随机分成4组，每组5只。5组试验犬分别饲喂基础饲粮+ZnSO4(锌添加水平为80 mg/kg，对照组)、基础饲粮+1.71 g/kg Zn-Pal(锌添加水平为40 mg/kg，Zn-Pal-40组)、基础饲粮+2.55 g/kg Zn-Pal(锌添加水平为60 mg/kg，Zn-Pal-60组)、基础饲粮+3.42 g/kg Zn-Pal(锌添加水平为80 mg/kg，Zn-Pal-80组)。比格犬购于扬州四方实验动物科技有限公司，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2012—0029。基础饲粮参照美国AAFCO(2016)犬营养需要进行配制，基础饲粮组成及营养水平见表1。饲养期包含预试期7 d、正试期30 d，于江苏农牧科技职业学院宠物营养试验动物房进行。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.3 饲养管理

所有试验犬单笼饲养于试验房内，免疫齐全。预试期内测试试验犬在5 min内的自由采食量以确定正试期的饲喂量。每天09:00时和16:00时给料饲喂，每次每只给料200 g，30 min后收集剩料，称重，日均采食量270 g/只；自由饮水，日均饮水量1 320 mL/只。

1.4 运输试验

在饲养试验结束时，试验犬单只圈于犬笼中，以约60 km/h的速度运输2 h。运输期间试验犬禁止喂食和饮水。

1.5 样品采集

于饲养试验结束时运输前对试验犬前肢静脉留置针采血，采集血液约8 mL于离心管中，而后4 500 r/min离心10 min，用微量移液器转移分离血清并至-20 ℃冰箱保存待测。运输结束后，对试验犬前肢静脉留置针采血于洁净离心管，4 500 r/min离心10 min分离血清，-20 ℃保存待测。

1.6 指标测定

1.6.1 血清免疫相关指标的测定

血清溶菌酶活性参考Yin等[28]的方法进行测定，血清免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行测定。

1.6.2 血清抗氧化相关指标和急性期反应物含量的测定

血清总抗氧化力(T-AOC)及总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)、葡萄糖(GLU)含量使用试剂盒进行测定，试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。血清皮质醇、热休克蛋白70(HSP70)含量使用ELISA试剂盒测定，试剂盒均购自南京奥青生物技术有限公司，试验操作严格按试剂盒说明书进行。

1.7 数据统计与分析

试验数据录入Excel 2021后采用SPSS 20.0统计软件对样本平均值进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法对组间差异进行多重比较，结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 Zn-Pal对犬血清免疫相关指标的影响

由表2可知，运输应激前，Zn-Pal-80组血清溶菌酶活性与对照组相比有所提高(P>0.05)；Zn-Pal-80组血清IgG含量显著高于对照组(P<0.05)；Zn-Pal-60组和Zn-Pal-80组血清IL-6含量显著高于对照组(P<0.05)；各组血清TNF-α含量无显著差异(P>0.05)。运输应激后，Zn-Pal-80组血清溶菌酶活性、IL-6含量均显著高于对照组(P<0.05)。

表2 Zn-Pal对犬血清免疫相关指标的影响

2.2 Zn-Pal对犬血清抗氧化相关指标的影响

表3所示，运输应激前，Zn-Pal-80组血清T-AOC和T-SOD活性显著高于对照组(P<0.05)；Zn-Pal-60组和Zn-Pal-80组血清MDA含量较对照组有所降低(P>0.05)；各组血清GSH-Px活性无显著差异(P>0.05)。运输应激后，与对照组相比，Zn-Pal-80组血清T-SOD活性显著升高(P<0.05)，血清MDA含量显著降低(P<0.05)；Zn-Pal-60组血清T-SOD活性和MDA含量分别升高和降低(P>0.05)；各组血清T-AOC、GSH-Px活性无显著差异(P>0.05)。

表3 Zn-Pal对犬血清抗氧化相关指标的影响

2.3 Zn-Pal对犬血清急性期反应物含量的影响

由表4可知，运输应激前，Zn-Pal-60组和Zn-Pal-80组血清皮质醇含量与对照组相比有所降低(P>0.05)。运输应激后，Zn-Pal-60组和Zn-Pal-80组血清皮质醇含量显著低于对照组(P<0.05)，Zn-Pal-80组血清HSP70含量显著低于对照组(P<0.05)。

表4 Zn-Pal对犬血清急性期反应物含量的影响

3 讨论

3.1 Zn-Pal对犬免疫能力的影响

动物通过机体免疫系统抵抗细菌、病原菌、运输应激等不良因素，血清免疫是机体体液免疫的重要部分。溶菌酶是一种碱性蛋白，是吞噬细胞吞噬病原菌的物质基础[29]。IgG是血清和细胞外液中含量最高的免疫球蛋白，是血清主要的免疫指标。IL-6在免疫应答中能促进肝细胞产生急性期蛋白，参与炎症反应，提高机体对局部感染的防御能力[30]。本试验发现，运输应激前，饲粮添加40 mg/kg的Zn-Pal会降低犬血清IgG、IL-6含量，而添加80 mg/kg的Zn-Pal可以显著提高犬血清IgG含量，添加60、80 mg/kg的Zn-Pal可以显著提高犬血清IL-6含量，提示饲粮添加一定量的Zn-Pal能够提高犬的免疫能力。这与在肉鸡上所得结果相似，研究表明，似粮添加Zn-Pal能提高肉鸡血清IL-6等免疫指标的含量[31]。Zhang等[20]在团头鲂上的试验也表明饲料添加90 mg/kg的Zn-Pal可以提高免疫功能。此外，也有报道显示，氨基酸锌可以提高贵宾犬的免疫功能[22]。本试验中，运输应激后，与对照组相比，饲粮添加80 mg/kg的Zn-Pal可以显著提高犬血清溶菌酶活性和IL-6含量，提示在锌添加水平一致(80 mg/kg)的情况下Zn-Pal可以缓解运输对犬造成的应激反应，且效果优于ZnSO4。这可能是由于凹凸棒石黏土的吸附和缓释功能改善了锌在犬肠道内的释放过程，促进了犬对锌离子的吸收和利用，提高了锌的利用率，从而改善了犬的免疫能力。

3.2 Zn-Pal对犬抗氧化能力的影响

正常情况下，健康动物机体氧自由基的产生和清除处于动态平衡状态[32]。动物生存生长过程中的不良因素如运输、高温、寒冷等可使动物体发生应激反应，从而导致体内产生大量的羟基自由基，破坏动物体内自由基的平衡状态。超氧化物歧化酶(SOD)是动物酶促抗氧化体系的重要氧化酶，能有效清除自由基，有助于减少和阻止脂质过氧化反应[33]。MDA是脂质过氧化的主要产物，可含量的高低反映氧化损伤的程度。本试验中，运输应激前，饲粮添加80 mg/kg的Zn-Pal时犬血清T-SOD活性显著高于对照组。锌是体内许多酶和激素的组成成分和激活剂，也是体内抗氧化酶如铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)的重要组成成分，在Cu/Zn-SOD的合成和代谢过程中具有重要作用。Zn-Pal能提高犬血清T-SOD活性可能是通过提高Cu/Zn-SOD活性来实现的。已有研究发现，饲粮中添加富锌益生菌后能显著提高犬血清SOD活性和T-AOC[34]。运输应激后，Zn-Pal-80组犬血清T-SOD活性显著高于对照组，血清MDA含量显著低于对照组。这可能是由于在运输应激条件下，抗氧化酶系统被激活以清除血液中由运输应激引起的自由基和脂质过氧化产物，上述结果提示，Zn-Pal具有提高犬的抗氧化能力和清除脂质过氧化产物的能力，可以缓解运输对犬造成的应激，添加效果以锌水平为80 mg/kg为佳。Yang等[35]报道，Zn-Pal可以提高21日龄肉鸡血清抗氧化能力，降低血清MDA含量，与本试验结果类似。

3.3 Zn-Pal对犬抗运输应激能力的影响

动物发生应激反应会引起体内糖皮质激素含量的升高[36]。皮质醇是重要的糖皮质激素，是机体遭受外界环境刺激时发生应激反应的指标。血液中的葡萄糖含量与皮质醇的分泌密切相关，是应激反应的二级产物。犬受冰水环境刺激后，血液皮质醇含量显著升高[37]。本试验结果表明，在运输条件下，犬血清皮质醇含量明显升高，提示犬发生了运输应激反应。本试验中，运输应激前，饲粮添加80 mg/kg的Zn-Pal具有降低血清皮质醇和葡萄糖含量的趋势，提示饲粮添加Zn-Pal能够改善犬抗应激能力。这可能是由Zn-Pal具有提高机体抗氧化能力和免疫能力的作用，从而提高了犬的抗应激能力。运输应激后，与对照组相比，饲粮添加80 mg/kg的Zn-Pal能显著降低犬血清皮质醇、HSP70含量，提示饲粮添加80 mg/kg的Zn-Pal能够有效缓解犬的运输应激反应，表明Zn-Pal作为一种锌源添加剂应用于犬饲粮中有良好的缓解运输应激作用。这可能是因为凹凸棒石黏土的吸附和缓释性可以改善Zn-Pal中锌的释放过程，提高了锌的利用率，从而使锌能更有效地发挥其生理作用，包括锌对激素、小分子蛋白代谢的有益作用等。据报道，Zn-Pal可以降低团头鲂在运输条件下肝胰腺热休克蛋白90(HSP90)基因表达水平，缓解运输产生的应激反应[20]。这与本试验中饲粮添加Zn-Pal可以提高犬的抗运输应激能力结果相似。