乳外泌体对机体免疫调节作用的研究进展

陈碧兰 黎 梦 张永亮 陈 婷*

(1.华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术中心，广东省动物营养调控重点实验室，广州510642；2.嘉兴学院生物与化学工程学院，嘉兴314001)

外泌体(exosomes，EVs)是释放到细胞外环境的纳米级磷脂双层囊泡，直径在30～150 nm，可由各种组织或细胞产生。外泌体由多泡核内体与质膜融合并通过胞吐释放到腔内[1-2]，多种类型的细胞、组织和生物液体可释放外泌体，包括血液、乳汁、尿液、唾液、眼泪和脑脊液等[3]。

母乳富含婴儿时期生长发育所需的各种营养物质，包括脂肪、蛋白质、碳水化合物、矿物质和维生素；还富含乳铁蛋白、免疫球蛋白、生长因子、寡糖、多不饱和脂肪酸等生物活性成分[4]。2007年，Admyre等[5]首次报道了人类母乳中还富含外泌体，但这些外泌体的来源仍不确定，自此，乳外泌体(milk-derived exosomes，MEVs)的研究成为学术上的一大研究热点。此外，乳外泌体可以作为细胞之间的信使，人们对乳外泌体的研究兴趣日益浓厚[6]。大量研究表明，乳外泌体可发挥调节机体代谢[7]、生长发育[6,8]、传递药物[9-11]以及免疫[8,12-13]等功能。本文综述了乳外泌体生物学特性及分离方法，并探讨了乳外泌体在免疫调节中的作用与机制，为丰富乳外泌体生物学功能提供了参考依据。

1 乳外泌体的生物学特性及分离

乳外泌体主要由乳腺上皮细胞释放的脂质、蛋白质和核酸(包括mRNA、miRNAs、lncRNA和DNA)组成[14]。乳外泌体具有生物活性，并能携带特定的生物信息分子[15-16]，其生物活性主要由其携带的生物活性分子来体现[17-19]；如各种乳外泌体脂质(主要是乳脂球膜)[18]、核酸[20-21]和蛋白质[22-23]等是乳外泌体传递的关键信号成分，能够进入体内并发挥特定的功能。此外，乳外泌体中的miRNAs具有高度的序列同源性[24-25]，特别是miRNA-let-7家族成员(let-7a、let-7b和let-7f)以及miR-148a等，这些miRNAs在所有物种中的保守性都非常高[25]。除了序列同源性，乳外泌体还表现出跨物种的耐受性，如牛乳外泌体可以被人肠道吸收并表现生物活性，且不会引发免疫反应[26]。将人乳外泌体中高表达的let-7家族和miR-148a转移到新生儿体内，可以参与靶mRNA的转录后调控实现跨物种交流[25,27]。

1.1 乳外泌体稳定性的影响因素

乳外泌体除了具有生物活性、miRNAs序列同源性和耐受性还表现出一定的稳定性，这些特征均为乳外泌体在跨物种的调控作用提供了前提条件。其中，乳外泌体的稳定性是研究各类乳外泌体及其成分功能的基础，但其稳定性可受以下因素影响。

1)酸性：乳外泌体的双层膜结构可以保护其在胃、胰液中不被消化，使其内容物不被核糖核苷酸酶和消化酶降解，从而进一步被肠道细胞吸收并发挥生物活性[28-29]。在体外消化模型中，乳外泌体中的miRNA可以抵抗酸性环境(pH=2和pH=4)及消化道酶的水解作用，而且可以被婴儿肠道细胞吸收并发挥生理功能；除此以外，乳外泌体对蛋白酶的水解作用具有高度抵抗性[17]。值得一提的是，肠道的酸性环境和高渗条件还可以进一步促进乳外泌体的稳定性和吸收[17]。

2)温度：温度可以影响乳外泌体的结构和miRNAs的表达量，是影响乳外泌体生物活性的重要环境因素。在冷藏或冷冻环境下，会导致母乳中的细胞大量迅速死亡[30]。将母乳放置在4 ℃环境中储存4周时，乳外泌体会减少到新鲜母乳的(49±13)%[30]，但将乳外泌体保存在-80 ℃数月后仍具有生物活性[9]。这表明乳外泌体在超低温环境下可以长期保存且不引起其物理和生物学特性的显著变化。此外，天然的乳外泌体miRNAs更能抵抗严酷的条件，包括反复冻融和高温。与外源合成的miRNAs相比，乳外泌体中的miRNAs可耐受更长时间的冷储存，miRNAs在4 ℃下储存15 d或者微波炉加热后仍具有生物活性，但会损失乳外泌体miRNAs的含量[31-32]。但值得注意的是，与巴氏杀菌(78 ℃)相比，牛奶的煮沸(100 ℃)和超热处理(130 ℃)可降低牛奶miRNAs水平[24,33-34]，这表明超高温可能会破坏乳外泌体的双层脂膜结构，引起其内部miRNAs的释放，进而降低乳外泌体中miRNAs的表达量。

3)发酵：牛奶发酵生产变成酸奶时，会在体外破坏乳源外泌体的完整性，导致蛋白质含量和miRNAs浓度降低[31]。因为发酵过程中可能使乳外泌体的膜结构裂解，而且微生物产生的大量核糖核酸酶(RNases)也会导致核酸降解[32]。

4)巴氏杀菌、均质化和其他乳产品加工方式：巴氏杀菌、均质化(miRNAs浓度平均降低50%)和乳产品加工均会导致乳外泌体及其内容物不同程度的损失，主要是通过破坏乳外泌体膜的完整性造成的[32-33]。其中，乳外泌体膜在均质化过程中会受到剪切力的作用，导致乳外泌体膜破坏和miRNAs降解[32]。

5)其他：母乳样本来源的树突状细胞死亡后会产生凋亡小体和细胞碎片，加速乳外泌体的污染[30]。

1.2 乳外泌体的分离方法

研究显示，在试验中很难根据蛋白质谱区分乳外泌体与凋亡小体和细胞碎片，这增加了乳外泌体分离和纯化的难度[30]。目前，用于乳外泌体分离的方法有超速离心法、密度分离法、沉淀法、超滤法和免疫亲和法等[35]，但不同的方法在纯度、得率和成本等方面差异较大[36-37]。研究表明，用沉淀法获得乳外泌体非常直接快速，但获得的乳外泌体中可能残留其他细胞碎片，缺乏对乳外泌体的特异性识别[35,38]；超速离心法操作简单，提取的乳外泌体数量较多，但存在耗时较长、单次处理数量有限以及回收率不稳定等特点，不适合大规模提取[39-40]；超滤法提取乳外泌体操作简单，但由于滤膜的黏附，可能会损失乳外泌体，并且由于过滤时的压力和剪切力，可能会使乳外泌体变形[41-42]。

上述研究表明，乳外泌体对各类环境条件的耐受能力较强，这为乳外泌体分离方法及其功能的研究和提供了重要依据。同时，现有乳外泌体的分离方法显示出的利弊，也为获得高纯度、高得率的乳外泌体提出了巨大挑战。但乳外泌体可以抵抗胃肠道的消化进而被动物体进一步吸收利用，为乳外泌体进入生物机体并发挥功能提供了重要保障。

2 乳外泌体作用方式

乳外泌体能参与免疫反应、细胞黏附、废物处理、应激保护和炎症等生物学过程，其主要通过传递各种蛋白质、脂质和RNA，以实现细胞间通讯[1,7]。据报道，目前乳外泌体与其他细胞或组织间的信号传递主要通过以下几种方式。

1)胞吞作用：许多体外研究表明，乳外泌体可以通过胞吞作用进入细胞质，然后通过基底外侧膜释放其miRNAs载体[43-45]。

2)配体-受体方式作用：乳外泌体还可以通过配体-受体方式进入机体，捕获配体从而发挥作用。研究显示，牛乳铁蛋白与聚L-赖氨酸的分子偶联物静电后能与带负电荷的siRNA相互作用，其中乳铁蛋白作为配体被存在于外泌体中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)捕获，有研究将siRNA装载到乳外泌体中，发现装载siRNA的载体蛋白乳外泌体不仅能安全运输治疗性siRNA，还能提高靶细胞内具有多种保护作用的乳铁蛋白的生物利用度[46]。

3)内吞作用：有研究表明，肠上皮细胞可以直接吞噬牛奶外泌体[17]。Wolf等[26]研究表明，牛乳外泌体在肠道的运输可以通过人血管内皮细胞的内吞作用来完成，是一种成本低、效益高的药物递送替代物。在生物制药行业中，乳外泌体被证明是有效的药物和小分子的运载体。牛乳外泌体作为药物传递载体的靶向机制可能是通过其表面糖蛋白和靶细胞的特异性识别[26]，涉及顶级网络通路与代谢、内吞作用、紧密连接和Ras信号通路等，且蛋白质的糖基化特性极大地影响乳外泌体与受体细胞的相互作用[14，47]。

3 乳外泌体的免疫增强作用

乳外泌体作为天然稳定的生物活性物质，其作用方式在动物摄取乳外泌体并发挥其特定生物学功能方面具有重要地位。据报道，乳外泌体在许多方面都发挥重要的生物学功能，如参与调节机体代谢[7]、维持骨骼健康[48]、调节肠道健康[49-51]以及免疫功能等。其中，Badawy等[52]首次证明骆驼乳外泌体可通过诱导凋亡、抑制炎症、抑制氧化应激、抑制血管生成来诱导乳腺癌细胞死亡，从而抑制乳腺肿瘤的生长；Gao等[49]发现乳外泌体能有效缓解缺氧造成的肠道损伤；牛乳外泌体和不同时期来源的人乳外泌体均可治疗由脂多糖诱导的坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)[53-54]；人类和牛的乳外泌体可以减少葡聚糖硫酸酯钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导的小鼠结肠缩短，促进肠细胞增殖缓解结肠炎[19]。

值得注意的是，还有大量研究表明，乳外泌体在细胞炎症、癌症和细胞增殖等生物学过程中能通过直接或间接方式发挥着重要的免疫调节作用[6,8,12-13]。

3.1 乳外泌体与炎症

炎症反应是自身免疫反应的一种表现，是机体为去除有害刺激以及修复受损组织愈合的一种保护性反应，涉及多种类型的免疫细胞的参与[55-56]。其中，先天免疫细胞可以通过感知和定位损伤以及感染相关的危险信号后，激活先天免疫细胞产生促炎性细胞因子，进一步增强炎症反应，同时发挥阻断病原体传播的作用[57]。乳外泌体作为信息传递分子，可调节细胞炎症相关基因的表达，缓解炎症损伤，从而增强机体免疫功能，保护动物健康。最新研究发现，在白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的体外软骨外植体关节炎模型中，牛乳外泌体可以减少软骨外植体释放硫酸盐黏多糖，抑制软骨细胞的炎症反应和分解代谢过程[58]。在溃疡性结肠炎的遗传小鼠模型中，牛乳外泌体可降低宏观结肠炎评分，阻止溃疡表型的出现，具有抗炎作用，但其背后的免疫机制还需进一步研究[51]。Good等[59]研究发现，人乳外泌体能够通过表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号通路抑制Toll样受体4(TLR4)，从而防止脂多糖诱导的NEC。在小鼠肠道类器官模型证明，人乳外泌体可以抑制炎症标志物肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和TLR4的表达，减少小鼠肠道类器官的大小，抑制由脂多糖诱导引起的促炎反应[49,60]，这也符合之前的报道。

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种慢性复发的胃肠道炎症性疾病，其中坏死性结肠炎是动物中最常见的胃肠道疾病，死亡率较高，迄今为止还没有找到治愈该病的方法[61]。目前，新兴治疗IBD的方法主要集中在免疫调节[19]。在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，乳外泌体可以降低白细胞介素-6(IL-6)和TNF-α的mRNA表达量，缓解DSS引起的结肠炎，其作用机制可能涉及多种互补途径[19]。另有研究发现，骆驼乳外泌体同样可以通过T细胞介导下调大鼠乳腺肿瘤组织中炎症相关基因的mRNA表达量来实现抗炎作用[52]。

以上结果表明，乳外泌体可以调节细胞炎症相关基因的表达，增强抵抗炎症的能力，从而达到缓解动物炎症的目的，具有增强机体免疫的作用。推测利用乳外泌体给药可能是未来有希望预防动物机体炎症、提高机体免疫力的有效方法之一。

3.2 乳外泌体与癌症

慢性炎症是癌变的刺激因素[62]。研究证明，乳外泌体不仅可以调控细胞炎症因子达到缓解炎症的作用，还能够对抗癌症，其发挥的免疫增强作用可用于临床辅助治疗癌症的手段[57]。乳外泌体可以通过控制癌细胞的表达和转移，从而达到抗癌的效果。研究证明，骆驼乳外泌体通过抑制肿瘤组织中血管生成相关基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，导致肿瘤组织营养和氧气供给减少来削弱肿瘤细胞的生存和转移能力，从而控制癌细胞转移，在抗癌方面发挥明显作用[52]。同样的，Reif等[63]报道，牛乳外泌体miR-148a可以抑制肿瘤细胞的增殖和转移。随后研究发现，乳外泌体miR-155和miR-148可以调节肠道细胞因子和T细胞免疫反应，预防结直肠癌癌变[57,64-65]。在免疫学上，检查点抑制剂是癌症免疫疗法中常用的制剂，其原理是阻断抑制信号，通过消除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，进而激活T细胞攻击肿瘤发挥作用[57]。目前，免疫疗法被视为癌症治疗的第四大支柱，它通过重新激活抗癌免疫反应，从而显著提高许多类型癌症的存活率[57]。因此，乳外泌体可作为检查点抑制剂应用于癌症治疗中。

乳外泌体在抗癌方面除了通过调节癌细胞的表达和转移，在实际应用中，更多的是作为载体运输药物，起到辅助免疫治疗的作用。由于乳外泌体的脂质膜和水核结构，天然和工程的乳外泌体已经证明可以作为小分子和大分子物质的运送载体运用于癌症治疗过程[35，66-67]。研究显示，乳外泌体可以有效地装载小分子药物，并可长期保存而不失去药物效力，将化疗药物装载到乳外泌体中，按照蛋白质浓度<6 mg/mL的标准存于-80 ℃，6个月后依然保持良好的药性[9]。在体外细胞试验和含肿瘤小鼠试验中，载药乳外泌体抑制肿瘤的效率明显高于游离药物，其原因可能是乳外泌体中的药物负载增加了稳定性、细胞摄取率和药物的缓释作用[9-10]。除此之外，研究发现运载siKRAS的牛乳外泌体可以抑制肺肿瘤异种移植物的肿瘤活性，并且能提高siRNA的负载能力及其稳定性[66]。乳外泌体作为药物运送载体重要的依据是其具有生物相容性，可以实现跨生物交流，并表现出一定的生物活性[25,27]。这为乳外泌体作为药物运送载体而不引起不良免疫反应提供了支持。同时，乳外泌体还可以与肿瘤配体靶向结合，进一步提高特异性并消除药物在健康细胞中的脱靶副作用[9]。

3.3 乳外泌体与上皮屏障

乳外泌体中的生物活性成分被吸收进入动物体内后，可以通过修复细胞屏障功能，达到调节免疫的作用。皮肤和黏膜屏障是先天免疫的组成部分，其上皮细胞的紧密连接是机体抵御病原体的第1道屏障，当其被感染或损伤破坏时，先天免疫机制几乎立即开始激活[57]。研究表明，屏障功能的改变可能会导致或增加疾病的发生，而靶向恢复屏障功能的治疗是一种替代或补充免疫治疗的方式[12]。

许多研究表明，乳外泌体具有促进细胞增殖，达到恢复屏障功能的作用，其免疫作用的发挥主要通过运输生物活性物质，如miRNA、mRNA、DNA和蛋白质，在细胞-细胞通信中实现的[1,14]。乳外泌体中的蛋白质可以形成蛋白质-蛋白质网络相互作用，通过蛋白质运载物在蛋白质水平上调节细胞过程，如Zonneveld等[38]首次证明，乳外泌体中的蛋白质可以作用于p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)或丝裂原细胞外信号调节激酶(mitogen extracellular signal-regulated kinase，MEK)-细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信号通路中的相关蛋白，通过增加上皮细胞的再上皮化率，来共同维持完整的口腔上皮屏障。除口腔上皮外，肠道是乳外泌体吸收和作用的重要场所。肠上皮细胞分泌的抗菌肽、黏蛋白和溶菌酶等先天免疫分子，是肠道先天免疫系统的重要组成部分[68]。肠上皮细胞的固有层中存在多种免疫细胞，这些细胞群为机体提供免疫保护、监测及杀死病原的作用[69]。因此，维持肠道屏障的完整性是增强机体免疫的重要内容。Reif等[19]在小鼠结肠炎模型中发现，乳外泌体可以有效降低DSS诱导的结肠缩短，促进结肠上皮细胞增殖，维持肠道屏障健康，从而缓解小鼠结肠炎的症状。Li等[54]发现，用啮齿动物的乳外泌体处理可以增加杯状细胞的数量和相关基因表达，如帮助葡萄糖调节蛋白94(glucose regulatory protein 94，GRP94)、黏蛋白2(mucin 2，MUC2)蛋白质合成，通过促进肠道上皮细胞增殖，维持肠道屏障健康。另有研究表明，乳外泌体能激活肠道增殖相关通路，促进肠道增殖和发育，维持肠道健康[6,70-71]，但对乳外泌体中促进细胞增殖具体的功能分子仍需进一步研究。Gao等[53]发现牦牛乳外泌体能有效地激活缺氧诱导因子信号通路，通过显著促进肠上皮细胞中氧敏感脯氨酸羟化酶-1(prolylhydroxylase-1，PHD-1)的表达，降低低氧诱导因子-α(hypoxia-inducible factors-α，HIFs-α)及其下游靶基因VEGF的表达，以及诱导p53表达降低，促进肠道再生。其中，p53蛋白被称为抑癌基因，是细胞周期的主要负调控因子。p53水平的快速上升会抑制细胞的生长，可以阻滞细胞周期和促进细胞凋亡进程，对细胞的正常生长和发育至关重要[72-73]。

关于乳外泌体增强屏障完整性的机制研究，报道显示miRNAs在细胞增殖和分化、组织发育以及免疫应答过程中发挥重要作用[74]，如在牛乳和人乳外泌体中已证明有部分miRNAs(如let-7家族成员包括let-7a、let-7b、let-7f以及miR-148a等)可参与调控细胞信号转导、细胞生长或维持细胞活力等相关的靶基因[25]。同时，口服从牛乳和人乳中分离的乳外泌体可上调miRNA的表达量，如miRNA-320、miRNA-148、miRNA-375和let-7a，下调DNA甲基转移酶(recombinant DNA methyltransferase，DNMT)中DNMT1和DNMT3的表达，诱导结肠细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和细胞增殖，增加免疫相关蛋白质的表达[25,63]。上述研究提示，乳外泌体可通过miRNAs发挥调控作用，如miR-200b通过转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)抑制上皮-间质转化，促进肠上皮细胞增殖[72]。在小鼠结肠炎模型中，miR-146b可通过核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)途径，减轻肠道炎症并改善肠道上皮屏障，在预防结肠炎方面发挥有益作用[43]。之后的研究发现，乳外泌体miRNAs(如miR-30c、miR-181a、miR-365-5p)能靶向抑制p53信号通路中靶向基因的表达，最终通过促进猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)增殖和紧密连接以及抑制细胞凋亡，缓解由脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)引起的肠道屏障损伤[35,75]。

乳外泌体具有促进上皮细胞增殖和生长的作用，进而增强机体免疫，且乳外泌体发挥促进细胞增殖作用的功能物质可能与其所含的miRNA密切相关[76]。但关于乳外泌体中的其他活性成分(如脂质、蛋白质、lncRNA和DNA等)在这方面的功能报道相对较少。

4 小结与展望

近年来，乳外泌体作为天然的生物活性物质，由于其生物相容性强、稳定性高、安全性高等特点成为学术研究领域的一大热点。此外，乳外泌体可以被机体吸收保持生物活性，并进一步向靶细胞传递生物信息，在炎症、癌症及细胞增殖方面发挥直接或间接的免疫调节作用。但当前对乳外泌体的研究也面临着一些问题：1)乳外泌体的分离和纯化在纯度、得率和成本等方面差异较大。对如何高纯度及高效地分离提纯乳外泌体的方法需要进一步完善，这直接限制了对乳外泌体研究的严谨性和准确性，故寻找新的分离提纯方法仍是现阶段研究的一大重点。2)对乳外泌体在免疫调节作用的研究中，主要针对的是乳外泌体群体，对其所含特异功能组分的研究相对较少，且主要集中在miRNAs。可能由于miRNAs较其他物质(如lncRNA、circRNA、蛋白质和脂质等)具有更高的序列同源性，因此，对乳外泌体中其他功能成分的研究可能会成为乳外泌体研究的一大突破点。3)乳外泌体已被作为药物和小分子的运送载体应用于靶向治疗癌症中，获得了较高的效益，但需要注意的是乳外泌体作为大分子药物转运载体不仅能转移新的化合物，而且也转移内在的乳外泌体内容物，重要的是可能转移病毒RNA或DNA[4]。因此，乳外泌体作为辅助免疫调节治疗手段的同时，需要注意其潜在风险。