异烟肼温敏型原位凝胶处方优化、体外释放及药代动力学分析

倪坚军 周中元 蔡鑫君

结核病由结核杆菌感染引起，主要侵袭患者肺部，故又称为肺结核[1-2]。肺结核患者中，约45.5%～63.3%合并支气管内膜结核，由于临床表现不明显，误诊、漏诊率高，易造成不可逆性支气管狭窄，严重者将造成呼吸困难、肺不张及继发性肺炎等恶性结局[3-5]。支气管结核病灶伴有广泛纤维增生，周围血管分布稀少，血运不良，严重影响药物的渗入，药物治疗效果不佳[6-8]。而原位凝胶不需要有机溶剂或共聚反应试剂，组织相容性良好，具有生物黏附性及溶液-半固态凝胶转变性质等特点，且制作工艺简便、应用方便、在用药部位滞留时间长及有良好缓释作用，近年来已被选择作为诸多药物载体[9-10]。异烟肼是抗结核治疗药物的首选，为克服结核患部血供不足、药物难以进入、难以达到抗结核治疗有效药物浓度的困难[11-12]，本研究以泊洛沙姆188（P188）和泊洛沙姆407（P407）为辅料，制备异烟肼温敏型原位凝胶，用于经纤维支气管镜介入治疗给药，以提高异烟肼在结核病灶中的停留时间和药物浓度，为支气管结核的临床治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料BALB/c小鼠，雄性，4～6周龄，（20±2）g；SD大鼠，雄性，约250 g；两者均购自上海斯莱克公司，由浙江中医药大学动物实验中心统一饲养，（22±2）℃，湿度50%～60%，14 h光照/10 h黑暗，换风15～20次/h。异烟肼标准品购自中国食品药品检定研究院，批号：100578- 201502；异烟肼原料药购自上海源叶生物科技有限公司，批号：R21A6T1；P188（批号：WPDI608B）、P407（批号：WPMI556B）、透析袋（截留相对分子质量8 000～14 000，型号：MD34）购自上海昌为医药辅料技术有限公司；荧光标志物Cy5.5 NHS ester购自杭州邦易化工有限公司，批号：H1824065。

1.2 方法

1.2.1 异烟肼温敏型原位凝胶制备及胶凝温度测定采用冷溶法[13]制备异烟肼温敏型原位凝胶。称取处方量的异烟肼、P407和P188，加入适量纯化水使溶解，混合均匀；4℃放置24 h，充分溶胀后去除气泡，得到澄清透明、分散均匀的异烟肼温敏型原位凝胶。采用倒置法[14]测定胶凝温度。制备好的异烟肼温敏型原位凝胶溶液置于西林瓶中，在水浴中慢慢加热，水浴温度从35℃开始以1℃/min速度升温，每升温1℃即取出西林瓶，倒置观察是否形成凝胶，直到西林瓶中的所有溶液全部变成凝胶，记录此时温度，每个样品重复3次。

1.2.2 原位凝胶处方的优化采用星点设计-响应面法对异烟肼温敏型原位凝胶处方进行优化。以P407、P188的质量分数为自变量（A和B），取值范围分别为20%～30%和0～6%；以胶凝温度（T）为因变量。根据星点设计原理，两因素一指标时，每个因素设5个水平，分别为±α、±1和0（α=1.414），见表1。采用Design-Expert 10.0.3软件进行二元多项式回归方程拟合，软件拟合的回归方程为T=132.823-6.464A+1.992B+0.066AB+0.088A2-0.364B2（R2=0.947 1），各项方差分析结果显示模型P＜0.01时认为该模型可靠有效。

表1 星点设计及响应值

采用Design-Expert 10.0.3软件生成二维等高线图，得到备选处方；利用1.2.1方法制备异烟肼温敏型原位凝胶并测定胶凝温度，与预测值比较，计算偏差=（预测值-实测值）/预测值×100%。偏差最小的处方确定为最优处方。

1.2.3 优化处方制备的异烟肼温敏型原位凝胶中异烟肼含量测定采用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）法测定异烟肼温敏型原位凝胶中异烟肼的含量。色谱条件：Agilent SB-C18色谱柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流动相：0.02 mol/L磷酸氢二钠（pH 6.0）-甲醇（体积比85∶15），流速1.0 ml/min，柱温35℃，检测波长262 nm，进样量10 μl。质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；以350℃氮气作为干燥气，控制流速及雾化器压力分别为12 ml/min，241.3 kPa，毛细管及解离能量分别为4 000 V及100 eV，碰撞能量36 eV及28 eV。在多反应检测模式下检测离子浓度，停留时间设置为550 ms。利用异烟肼标准品制备1.015 g/L的标准贮备液，用流动相分别稀释成1015.00、507.50、304.50、203.00、101.50、81.20、60.90、40.60、20.30、10.15 mg/L的异烟肼标准溶液，利用LC-MS/MS法分别检测各标准溶液的峰面积，建立异烟肼质量浓度的标准曲线。利用LC-MS/MS方法测定优化处方后制备的异烟肼温敏型原位凝胶的峰面积，根据标准曲线计算凝胶中异烟肼质量浓度。

1.2.4 精密度、重复性和稳定性试验精密移取高（1 000 mg/L）、中（90 mg/L）、低（8 mg/L）3个不同浓度标准品溶液，采用LC-MS/MS测定各对照品溶液的峰面积，连续测定5 d，计算日内和日间精密度。精密配制异烟肼原位凝胶溶液，浓度约为110 mg/L共5份，检测每份样品的峰面积，分析该测定方法的重复性。检测同一份异烟肼原位凝胶溶液放置0、1、2、4、8、12、24 h后的峰面积，考察异烟肼原位凝胶溶液的稳定性。重复性、精密度等试验要求相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）不超过2.0%。

1.2.5 异烟肼温敏型原位凝胶体外释放试验精密吸取5 ml异烟肼温敏型原位凝胶加入透析袋内，扎紧袋口，放入装有100 ml PBS[pH 7.4，（37±1）℃]溶液的广口瓶中。采用LC-MS/MS法测定不同时间点（15、30、45、60、75、90、120、150、180、240、270、300 min）PBS溶液中异烟肼的浓度，计算相对累积释放率。以异烟肼水溶液为对照。利用零级动力学方程、一级动力学方程、Weibull方程等对异烟肼温敏型原位凝胶体外溶蚀曲线进行拟合。

1.2.6 异烟肼温敏型原位凝胶药效学研究采用小鼠活体成像实验。取6只BALB/c小鼠，随机分成A组和B组，每组3只。A组使用Cy5.5 NHS ester标记的异烟肼温敏型原位凝胶，B组使用Cy5.5 NHS ester标记的异烟肼水溶液。利用气管注射给药，20 μl/只，具体操作如下：小鼠麻醉后，嘴巴张开固定，将Exel SafeletⅣ导管插入气管，取出导管上的针头，将小鼠移入生物安全柜，用吸管将异烟肼原位凝胶或异烟肼水溶液注入导管开口，小鼠吸入凝胶或水溶液后，取出导管，将小鼠置于加热灯下恢复。给药完成后观察小鼠状态，于0、0.5、1、2、4、7、72 h时拍摄，检测Cy5.5 NHS ester荧光分布、强度及小鼠生理情况。

1.2.7 异烟肼温敏型原位凝胶药动学研究取10只SD大鼠随机分为A组和B组，每组5只。A组使用异烟肼温敏型原位凝胶，B组使用异烟肼水溶液，气管注射给药，注射剂量为16 mg/kg（按异烟肼剂量计算），200 μl/只。分别于给药后15、30、60、120、180、240、360 min时眼眶取血，离心后取上层血浆，利用LC-MS/MS法检测两组大鼠血浆中异烟肼质量浓度，绘制血浆异烟肼质量浓度-时间曲线图，利用WinNolin软件计算异烟肼温敏型原位凝胶的药动学参数。

1.2.8 大鼠血样中异烟肼含量的测定利用LC-MS/MS法，色谱条件与1.2.3一致。精密称取异烟肼标准品10.05 mg，用纯化水溶解，定容至10 ml，制成1.005 g/L的储备液，将储备液分别稀释为10.05、20.10、40.20、100.50、201.00、502.50 mg/L的异烟肼标准液。精密量取空白血浆200 μl于离心管，再加l00 μl上述不同浓度的异烟肼标准液，加700 μl甲醇沉淀蛋白，配制成浓度为1.005、2.010、4.020、10.05、20.10、50.25 mg/L的溶液。将上述溶液旋涡混合1 min后，用高速离心机（5 000 r/min）离心8 min后，取上清液，过0.22 μm的滤膜后，进样。利用测得峰面积与配制的异烟肼血浆标准溶液浓度计算线性回归方程。精密量取样品血浆100 μl于离心管，加400 μl甲醇沉淀蛋白，旋涡混合1 min后，用高速离心机（5 000 r/min）离心8 min后，取上清液，过0.22 μm的滤膜。利用LCMS/MS法测定大鼠血浆的峰面积，计算大鼠血浆中的异烟肼含量。精密度、重复性、回收率实验参考1.2.4。精密度、重复性、回收率等试验要求RSD不超过2.0%。

1.3 统计学处理采用SPSS 16.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t或SNK-q分析。采用Design-Expert 10.0.3软件绘制自变量与因变量三维曲面图及等值线图。采用WinNonlin 6.4软件计算药代动力学参数。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异烟肼原位凝胶最优处方的选择当P188质量分数恒定时，随着P407质量分数增大，胶凝温度逐渐下降；当P407质量分数恒定时，随着P188质量分数增大，胶凝温度逐渐升高，见图1。以略低于人体体温的35℃作为胶凝温度，生成3个优化处方：处方1中P407质量分数为25.0%、P188为3.5%；处方2中P407为24.0%、P188为2.2%；处方3中P407为23.0%、P188为1.3%。利用筛选出的3个处方制备异烟肼温敏型原位凝胶，测定胶凝温度，并利用回归方程拟合对应的胶凝温度。结果显示，处方1即P407为25.0%、P188为3.5%时，胶凝温度偏差最小，即处方1为最优处方，见表2。

表2 异烟肼温敏型原位凝胶处方胶凝温度验证

图1 P407、P188质量分数对胶凝温度的影响（a：等高线图；b：维曲面图）

2.2 优化处方制备的异烟肼温敏型原位凝胶中异烟肼质量浓度测定LC-MS/MS法测定优化处方后制备的异烟肼温敏型原位凝胶的含量，以A为峰面积，C为药物浓度，得到线性回归方程为A=17.221C-1.949 1（R2=1.000 0）。精密度检测发现高（1 000 mg/L）、中（90 mg/L）、低（8 mg/L）3个浓度的异烟肼溶液RSD分别为0.103%、0.272%、0.471%；重复性考察发现检测5份相同浓度的异烟肼溶液的RSD为0.550%，说明建立的方法符合方法学要求。稳定性检查发现检测同一份异烟肼原位凝胶溶液放置0、1、2、4、8、12、24 h后的峰面积RSD为0.210%，表明制备的异烟肼温敏型原位凝胶的含量在24 h内稳定。

2.3 优化处方制备的异烟肼温敏型原位凝胶体外释药比较异烟肼水溶液在60 min时药物已基本释放完全，累积释放百分率为94.40%；优化处方后制备的异烟肼温敏型原位凝胶在30 min时，累积释放百分率为55.18%，120 min后释药曲线渐趋平稳，累积释放百分率为81.90%，300 min时累积释放百分率为84.35%，见图2。

图2 异烟肼水溶液和异烟肼温敏型原位凝胶的体外释放曲线

2.4 异烟肼温敏型原位凝胶的药效学气管注射后，两组小鼠状态良好，均未出现因阻塞气道致死的情况。小鼠给药后0、0.5、1、2、4、7、72 h的活体成像实验结果表明，A组小鼠体内的Cy5.5 NHS ester荧光信号较B组小鼠强。随着时间延长，两组小鼠体内的荧光信号均逐渐降低，但A组降低速度慢于B组。给药后0.5～4 h两组小鼠荧光信号强度差异最大。检测荧光信号分布情况发现，两组荧光信号定位都较为准确，表明注射的药物未出现脱离给药部位情况，见图3。

2.5 异烟肼温敏型原位凝胶的药动学以A为峰面积，C为药物浓度，使用LC-MS/MS法建立的线性回归方程为A=28.476C-16.45（R2=0.999），线性范围为1.005～50.250 mg/L。精密度检测发现高（50.250 mg/L）、中（10.050 mg/L）、低（2.010 mg/L）3个浓度的异烟肼血浆标准溶液的RSD分别为0.70%、1.20%、0.83%，重复性考察发现检测5份相同浓度的异烟肼血浆标准溶液的RSD为1.050%，说明建立的方法符合方法学要求。回收率实验发现精密移取适量的高、中、低质量浓度的异烟肼血浆标准溶液，回收率平均为98.26%，RSD为1.610%。说明该方法适用于血浆中异烟肼含量的测定。

LC-MS/MS检测发现两组大鼠体内异烟肼的药物浓度均在给药后30 min达峰，峰浓度分别为（40.28±0.43）和（6.35±0.63）mg/L（P＜0.05）；随着给药时间延长，两组大鼠体内异烟肼浓度逐渐降低，见图4。计算两组大鼠体内异烟肼的药代动力学参数结果发现A组大鼠体内异烟肼的AUC0-∞是B组的2.82倍，B组的异烟肼清除率（CL）是A组的1.41倍，见表3。

表3 药代动力学参数

图4 异烟肼浓度-时间曲线

3 讨论

结核病中肺结核最为常见，而其中有近一半为支气管结核[15-16]。支气管结核由结核杆菌感染引起，感染途径分为肺结核病灶中直接植入支气管黏膜和通过支气管周边组织直接侵及[17-19]。支气管结核病治疗周期长，传统给药方式下患者治疗依从性较差，使得病菌产生耐药性，加大治疗难度[20-22]。采用原位凝胶进行治疗，可使药物缓慢释放，无需频繁给药，提高治疗效果。本研究通过星点设计-响应面法，以P407和P188为影响因素，胶凝温度为因变量，对异烟肼温敏型原位凝胶处方进行了优化，弥补了原有凝胶制备方法中胶凝温度高、毒性大的缺点。相比异烟肼水溶液，优化处方后制备的异烟肼原位凝胶在小鼠体内具有更高的药物浓度，且清除率低，具有缓释的效果，为临床异烟肼治疗支气管结核提供了新思路。

P407及P188被用来优化原位凝胶处方，使达到最佳凝胶温度[23]。研究表明，凝胶温度与P407质量分数负相关，与P188质量分数正相关[24-25]，与本研究结果相似，因此调节P407和P188在凝胶处方中的质量分数可调节凝胶温度。当P407质量分数≤20%时，P188用量即使极低，胶凝温度也高于人体正常体温（37℃），而当P407质量分数≥30%，P407无法完全溶胀，且胶凝温度低于室温（25℃），需大量P188才能达到较为理想的胶凝温度。故本研究中设定P407质量分数为20%～30%，P188为0～6%，避免了溶胀及用量过大等问题。星点设计-响应面法优化异烟肼温敏型原位凝胶处方并确定最优处方中P407质量分数为25.0%、P188质量分数为3.5%，发生相转变温度为34.2℃。该温度高于环境温度且低于人体温度，为异烟肼温敏型原位凝胶应用提供了前提。

注：A组使用异烟肝温敏型原位凝胶；B组使用异烟肼水溶液

作为治疗支气管结核药物，异烟肼需从温敏型原位凝胶中释放，且在病灶部位停留较长时间，即药物需要具备一定缓释能力。本研究考察了优化处方后制备的异烟肼温敏型原位凝胶体外释放及滞留能力，结果显示给药后120 min，凝胶中异烟肼累积释药率达84.35%，释放时间长于水溶液（60 min）。异烟肼原位凝胶释药曲线符合Weibull方程，与张利竣等[24]研究相似，表明本研究制备的凝胶释药缓慢、持久，且释药完全。在使用时可使药效充分发挥，减少用药次数。小鼠活体成像结果也显示该处方制备的异烟肼温敏型原位凝胶安全性好，在给药部位滞留时间长。药动学研究发现，采用气管注射方式给药，相比水溶液，温敏型原位凝胶血药峰浓度较大，消除较慢，药物代谢时间长，对支气管结核的治疗效果也更好[25]。本研究中，凝胶组异烟肼质量浓度是水溶液组的6.3倍，之后随着给药时间的延长，两组小鼠体内异烟肼浓度逐渐降低，但其具体原因尚未完全明确，还需后续深入研究，探讨其具体机制。

综上所述，本研究优化处方制备的温敏型原位凝胶可提高药物治疗浓度，延长药物维持时间，减少用药次数，临床价值较好，且能避免临床上用药不足、不按时及不足疗程等问题。