模拟口腔加工对馒头体外淀粉消化特性的影响

任 欣， 王林萱， 张 敏, 方 圆， 张晨阳

(1.北京工商大学 食品营养与人类健康北京高精尖创新中心/北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048；2.国家粮食产业(青稞深加工)技术创新中心， 北京 100048)

固态食物的口腔加工作为消化系统的第一步，同时包括2个动作:通过机械咀嚼将食物分解成小颗粒和通过分泌唾液将颗粒润湿，利于吞咽[1]。前期有关体外模拟淀粉消化研究中，人们重点关注淀粉基食品在胃及小肠中的消化，而口腔加工作为消化系统的第一步，长期以来受到的关注较少。口腔加工仅被视为一种粗糙的机械加工，人们粗略地认为食物在短时间内(20～30 s)几乎没有发生化学变化[2]。在体外模拟淀粉消化过程中，多数研究仅通过简单的、不统一的机械破坏方法来模拟口腔加工过程[3]，其中粉碎及研磨是最常用的样品前处理方法。然而已有研究指出，样品的体外淀粉消化率与体内真实消化情况相差较大[4]，这很可能是由于样品前处理，即口腔加工环节不能较好模拟体内咀嚼情况。

食物颗粒大小已被证实是决定食物血糖生成指数的关键因素[5]，咀嚼过程可以细化食品的原始粒度。一般而言，随着粒度的减小，食品的表面积增加，酶的可及性增强[6]。与此同时，口腔加工过程中唾液与食物颗粒混合在一起，可以起到水化和润滑口腔的作用，唾液中的α-淀粉酶可以导致淀粉的瞬时水解[7]。

因此，本研究以青稞馒头和小麦馒头为模型食品，探讨不同模拟口腔加工处理方法对馒头类制品体外模拟淀粉消化特性及消化动力学的影响，以期揭示口腔加工在体外模拟消化过程中的关键地位，探求更接近人体咀嚼状况的体外模拟淀粉消化的样品前处理方法，并为血糖控制人群提供膳食指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

北青3号青稞(总淀粉质量分数0.7%、蛋白质质量分数9.6%、脂肪质量分数2.2%、膳食纤维质量分数13.5%、水质量分数12.2%),山西东方亮生命科技有限公司；金沙河小麦粉(总淀粉质量分数67.6%、蛋白质质量分数12.2%、脂肪质量分数2.0%、膳食纤维质量分数5.5%、水质量分数13.1%)、食盐，北京永辉超市；胃蛋白酶(P7000,酶活≥250 U/mg)、淀粉葡萄糖苷酶(10113，酶活≥120 U/mg)、转化酶(I4504,酶活≥300 U/mg)、胰酶(P7545)，美国Sigma公司；葡萄糖测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；氢氧化钾、乙酸、无水乙醇等，均为分析纯，北京半夏科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

JHMZ 200型和面机，北京东孚久恒仪器技术有限公司；F200- PRO型酶标仪，帝肯贸易有限公司；SALD- 2300型粒度仪，日本岛津公司；TMS- Pilot型质构仪，美国FYC公司；THZ- 82A型水浴恒温振荡器，北京天林恒泰科技有限公司；DF 101S型磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；VORTEX- 2型涡旋混合器，美国Scientific Industries 仪器公司。

1.3 实验方法

1.3.1青稞粉的制备

青稞生粉依次由80目和120目筛粉碎得到。

青稞挤压粉由青稞生粉经80目筛粉碎机粉碎后，进行挤压膨化处理[8]，螺杆转速为260 r/min，1～4区温度分别为40、70、100、150 ℃，模口直径3.9 mm，粉碎后过120目筛得青稞挤压粉。

1.3.2样品的制备

青稞馒头：称取一定量青稞生粉、青稞挤压粉、小麦粉(质量比1∶1∶3)，将其与37 ℃水[料液比(g/mL)为2∶1]、0.5%酵母混合均匀后，用和面机(4档)和面4次，30 ℃醒发箱发酵2～3 h，揉搓成团，于蒸锅中蒸25 min。

小麦馒头：以小麦粉为原料，制作方法与青稞馒头一致。

1.3.3唾液和酶液的制备

人工唾液制备：依次将氯化钠0.4 g、氯化钾0.4 g、氯化钙0.795 g、磷酸二氢钠0.78 g、硫化钠0.005 g、尿素1.0 g、羧甲基纤维素10.0 g、α-淀粉酶59 mg，加入1 L去离子水中混匀[9]。

混合酶液制备：取0.75 mL 1 200 U/mL的淀粉葡萄糖苷酶溶液和1 mL 3 000 U/mL的转化酶溶液加入15 mL的胰酶上清液中混匀，得到混合酶溶液，使用前37 ℃预热[10]。

1.3.4青稞馒头与小麦馒头的模拟口腔加工方法

1)切块(C)加工：用刀将馒头切成3 cm×3 cm×3 cm的颗粒，然后称取5 g馒头颗粒放入装有3.745 g去离子水的50 mL离心管中。

2)切块+涡旋(CV)加工：用刀将馒头切成3 cm×3 cm×3 cm的颗粒，然后称取5 g馒头颗粒放入装有3.745 g去离子水的50 mL离心管中，3 200 r/min涡旋30 s。

3)切块+研磨(CY)加工：用刀将馒头切成3 cm×3 cm×3 cm的颗粒，然后称取5 g馒头放入装有3.745 g去离子水的研钵中，用研杵手动按压30次。

4)切块+涡旋+人工唾液(CVR)加工：用刀将馒头切成3 cm×3 cm×3 cm的颗粒，然后称取5 g馒头颗粒放入装有3.745 g人工唾液的50 mL离心管中，3 200 r/min涡旋30 s。

5)切块+研磨+人工唾液(CYR)加工：用刀将馒头切成3 cm×3 cm×3 cm的颗粒，然后称取5 g馒头放入盛有3.745 g人工唾液的研钵中，用研杵手动按压30次，移入50 mL离心管中。

6)口腔咀嚼(HM)：志愿者(女性，22岁)，牙列完整，咬合正常，要求志愿者咀嚼一块馒头(5 g)，直到准备吞咽时，吐出食团，用于后续测定。志愿者口腔咀嚼和食团收集方式参考本实验室前期建立的方法[11]。

1.3.5粒径的测定

将模拟口腔加工后的馒头样品与蒸馏水混合，采用激光衍射粒度分析仪测定均匀化的颗粒样品的粒度分布，相对折射率为1.70[6]。

1.3.6水分含量的测定

参考GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》进行。

1.3.7质构的测定

样品质构通过在质构仪进行TPA双重压缩测试来测量[12]，样品以5 mm/s的速度压缩到高度的50%，以5 mm/s的速度返回，等待5 s再次施力。第一个峰值力为硬度。

1.3.8体外淀粉消化率的测定

1.3.8.1 淀粉消化速率测定

准确称取0.4 g经过不同模拟口腔加工的馒头置于50 mL离心管中，向其中加入5颗小玻璃珠和10 mL新鲜配制的0.5%胃蛋白酶溶液，涡旋混匀后横向放入37 ℃水浴振荡器中振荡，30 min后向离心管中加入10 mL 0.1 mmol/L的醋酸盐缓冲溶液(pH值5.5)，涡旋混匀后取0.2 mL消化液于4 mL无水乙醇中进行灭酶，1 500 r/min离心5 min后取上清液用于测定0 min时的葡萄糖释放量。

向模拟胃消化后的离心管中加入5 mL混合酶溶液以启动消化，涡旋混匀后横向放入37 ℃水浴中震荡，分别于模拟肠消化的20、40、60、90、120、180 min时取0.2 mL消化液于4 mL无水乙醇中进行灭酶，1 500 r/min离心5 min后取上清液用于测定模拟肠消化过程中葡萄糖释放量。

总葡萄糖释放量(TG)的测定：将消化180 min后的消化液充分涡旋后取出5 mL，沸水浴加热30 min后冰水浴15 min冷却至0 ℃，加入2.118 mL 7 mol/L的氢氧化钾溶液，冰水浴30 min。然后分别取0.2 mL样本溶液加入1 mL含40 μL 100 U/mL的淀粉葡萄糖苷酶的1 mol/L的醋酸溶液中，70 ℃水浴加热30 min后沸水浴10 min，冷却至室温后再加入20 mL去离子水，1 500 r/min离心5 min后取上清液用于测定总葡萄糖的释放量。

1.3.8.2 葡萄糖含量的测定

葡萄糖含量的测定严格按照试剂盒操作说明进行。反应溶液在37 ℃温育10 min后用酶标仪在505 nm处测吸光度。分别配制浓度为0.125、0.250、0.500、1.000、1.500、2.000、2.500 mmol/L的葡萄糖标准溶液，绘制标准曲线，标准曲线回归方程为Y=5.890 6X-0.212 5(R2=0.999 4)。

1.3.9预估血糖生成指数的测定

测定体外模拟淀粉消化过程中20、40、60、90、120、180 min时葡萄糖含量，利用式(1)对消化过程进行拟合[13]，计算体外淀粉消化动力学参数。以小麦馒头为参照物，通过待测样品水解曲线下面积与参照物水解曲线下面积的比值计算得出水解度(HI)，通过式(2)计算预估血糖生成指数(eGI)。

C=C∞(1-e-kt) ；

(1)

eGI=39.71+0.549HI。

(2)

式(1)、式(2)中，C∞为最终水解平衡时的葡萄糖水解率，%；k为动力学常数，min-1；t为水解时间，min。

根据体外消化数据，淀粉可被分为不同消化组分，快消化淀粉(RDS)、慢消化淀粉(SDS)及抗性淀粉(RS)[14]，不同组分的含量计算见式(3)～式(6)。

RDS=(G20-FG)×0.9/TS；

(3)

SDS=(G180-G20)×0.9/TS；

(4)

TS=(TG-FG)×0.9 ；

(5)

RS=(TS-G180)×0.9/TS。

(6)

式(3)～式(6)中，G20为体外水解20 min时释放的葡萄糖质量，mg；G180为体外水解180 min时释放的葡萄糖质量，mg；FG为游离葡萄糖质量，mg；TS为总淀粉干质量，mg；0.9为转换系数。

1.4 数据处理

所有实验重复3次。数值以平均值±标准差表示。采用IBM SPSS Statistics 25.0进行数据分析，用Origin 2018绘图，P<0.05表示显著性差异。

2 结果与分析

2.1 模拟口腔加工对馒头物理指标的影响

2.1.1对馒头表观形态的影响

青稞馒头和小麦馒头采用不同的体外模拟口腔加工方式及体内口腔咀嚼得到的样品形态如表1。由表1可直观地看出，简单的切块处理后，馒头结构松散；研磨过后，馒头呈扁平状；涡旋以及添加人工唾液后，馒头成团块状，结构相对紧实。

表1 不同体外模拟口腔加工后青稞馒头和小麦馒头表观形态

2.1.2对馒头质构的影响

图1显示了不同体外模拟口腔加工方式对青稞馒头和小麦馒头硬度、内聚性、弹性、咀嚼性和胶黏性的影响。

由图1可知，青稞馒头的平均硬度(20.00 N)显著高于小麦馒头 (13.00 N)(P<0.05)；未添加人工唾液的食团颗粒硬度明显高于添加人工唾液后的食团颗粒硬度；而2种馒头CVR、CYR、HM处理组食团硬度无显著性差异，结果表明体外模拟口腔处理对样品硬度有实际影响[15]，且添加人工唾液比单纯物理方法得到的食团颗粒硬度更低。这可能是因为切块和研磨的方法能够很好地控制颗粒的大小和形状，而不会过度破坏其多孔结构，而与人工唾液混合的过程，大大减小了颗粒的尺寸，并产生了粒度均匀的小颗粒[16-17]。与未添加人工唾液的处理方式相比，CVR和CYR处理组食团具有更低的硬度(青稞馒头3.23～3.77 N,小麦馒头0.73～1.85 N)和更低的胶黏性(青稞馒头1.49～1.71 N,小麦馒头1.19～2.02 N)。在所有的模拟口腔加工方法中，C处理得到的样品内聚性最高，CVR和CYR处理得到的样品内聚性最低。

不同小写字母表示同一时间不同加工方式的样品差异显著(P<0.05)。图1 不同体外模拟口腔加工后青稞馒头和小麦馒头的物理特性Fig.1 Physical properties of highland barley and wheat steamed bread after different in vitro simulated oral processing

样品较硬的质地很大程度上归因于其较低的水分含量[18]。本研究结果显示，食团硬度与水分含量呈极显著负相关(r=-0.980 64,P<0.05)，与前期体内研究结果一致[15]。人工唾液的添加是导致胶黏性差异的主要原因[19]，在本研究中使用的人工唾液缺乏黏蛋白，这导致添加了人工唾液的样品比没添加的胶黏性更低。在5种不同的体外模拟口腔加工方法中， CVR和CYR处理后馒头的低胶黏性可能与其小粒度和强烈混合作用有关[20]，这2种方法促进了人工唾液的均匀吸收和颗粒表面的良好湿滑性。体外模拟口腔处理方式对馒头质构有显著影响， CVR和CYR处理食团与HM实际情况最为接近。

2.1.3对馒头粒径的影响

在体外模拟口腔加工过程中，因为涡旋、研磨和唾液浸渍处理，馒头从一种充气固体转变为一种明显均匀的、潮湿的糊状混合物[21]。不同体外加工处理后，馒头外观不同，结构被破坏的水平也不同，CVR和CYR处理使馒头基质剧烈地解体，表现为大量的小颗粒(表1)。不同体外模拟口腔加工方式对馒头粒径的影响见图2。未添加人工唾液和添加人工唾液的体外模拟口腔加工方法存在明显差异，小麦馒头的粒径主要分布在374～471 μm(C、CV、CY组)和155～352 μm(CVR、CYR组)，青稞馒头的粒径主要分布在541～526 μm(C、CV、CY组)和282～351 μm(CVR、CYR组)。

不同小写字母表示同一时间不同加工方式的样品差异显著(P<0.05)。图2 不同体外模拟口腔加工后青稞馒头和 小麦馒头的粒径Fig.2 Grain size of highland barley and wheat steamed bread after different in vitro simulated oral processing

5种加工方法中，CVR组的颗粒最小。与口腔咀嚼相比，本研究采用的体外模拟口腔加工方法在缩小颗粒尺寸方面效率较低。且粒度大小与唾液的添加有关，唾液吸收改变了细胞壁强度[22]，并导致了粒径的减小。

在体外模拟消化的20、40、60、90、120、180 min，不同体外模拟口腔加工方式对粒径影响如图3。C、CV、CY组的初始颗粒较大，并逐渐分解为较小的颗粒。相比之下，CVR组初始颗粒尺寸小，在整个模拟胃消化过程中变化不大。不同模拟口腔加工方法之间的差异在胃消化结束时减小。结果表明：颗粒缩小速率随初始颗粒尺寸的不同而变化，而颗粒缩小程度则由不同体外加工方式决定。

由图3可知，通过CVR处理的青稞馒头，初始粒径在281.34 μm，在180 min时的粒径为157.89 μm，在整个消化过程中，颗粒的缩小速率在68.89 μm/min，而C、CV、CY的方式，颗粒缩小速率维持在40～50 μm/min，不同模拟口腔加工方式对颗粒缩小程度的影响有明显差异。且在180 min时，CVR的粒径(157.89 μm)是最为接近180 min HM的粒径(143.81 μm)。CVR处理的小麦馒头初始粒径在155.05 μm，180 min时粒径为83.09 μm，同样最为接近180 min HM组粒径(68.06 μm)。进一步验证通过CVR处理的食团在消化过程中，基质大量裂解成小颗粒，更为接近口腔咀嚼的真实状况。

不同小写字母表示同一时间不同样品差异显著(P<0.05)。图3 青稞馒头和小麦馒头不同消化节点的粒径变化Fig.3 Grain size changes of different digestive nodes of highland barley and wheat steamed bread

无论采用何种体外加工方法，淀粉水解速率都会随着时间的推移而降低。平均而言，消化初期的反应速率最高；在消化的后期，由于底物的耗尽，淀粉水解的速率降低。小肠中淀粉水解的速度和程度取决于消化过程中肠道中食团颗粒大小。一般来说，淀粉食品的大小和表面积是淀粉水解速率的主要决定因素。与口腔和胃阶段相比，肠道中食团的粒径崩解要小得多。CVR处理组观察到的淀粉消化程度较高，是因其粒径较小，这有助于在肠道阶段进行更彻底的消化。

2.1.4对馒头水分含量的影响

不同模拟口腔加工方法对馒头水分含量的影响见图4。经由CVR和CYR处理的样品水分含量(62%～64%)远高于C、CV、CY处理的样品(40%～42%)(P<0.05)。CVR和CYR方法产生的高水分含量可能与颗粒粒径小、比表面积大有关，从而提高了食团与唾液的混合效率有关。并且淀粉水解水平与粒径呈显著负相关(r=-0.934 94,P<0.05)，粒径越小，淀粉水解率就越高。还应注意的是，在体外制备过程中，并不是100%的人工唾液被吸收到组织中[23]。人工唾液吸收量的差异可能会影响淀粉在口腔期的水解，在体外研究中应考虑到这一点。

不同小写字母表示同一时间不同加工方式的样品差异显著(P<0.05)。图4 不同体外模拟口腔加工后青稞馒头和 小麦馒头的水分含量Fig.4 Moisture content of highland barley and wheat steamed bread after different in vitro simulated oral processing

2.2 体外模拟口腔加工对馒头体外淀粉消化率的影响

本研究测定了不同体外模拟口腔加工方式对青稞馒头和小麦馒头体外淀粉消化率的影响，见图5。青稞馒头和小麦馒头体外淀粉消化率在早期迅速增加，随后缓慢增加，最终在120 min时趋于平稳。不同体外模拟口腔加工方式使淀粉消化率存在显著性差异(P<0.05)。添加人工唾液的体外口腔加工方法的淀粉消化率都高于同时间没有添加人工唾液的体外口腔加工方法，这可能是由于人工唾液中含有α-淀粉酶[20]。当食物颗粒与人工唾液相接触时，α-淀粉酶通过切断α-1,4-糖苷键来分解直链淀粉和支链淀粉[24]，α-淀粉酶存在于人体唾液中，当食物进入口腔后，由于口腔咀嚼的持续时间较短，人们通常认为α-淀粉酶在食物的淀粉消化过程中作用不大[25]，因此在体外模拟淀粉消化率测定的前处理过程中，通常只考虑将食物破碎成小颗粒以模拟食物在口腔被咀嚼破碎的过程，忽略了α-淀粉酶的作用。从图5可看出，α-淀粉酶对淀粉消化率有较大的影响。有学者研究发现，α-淀粉酶在经过短暂的口腔咀嚼阶段后很长一段时间内仍能在胃中保持活性，继续水解食物中的淀粉[4]，甚至可能到达小肠而不失活[26]，表明唾液中的α-淀粉酶对淀粉水解起重要作用。此外，食物颗粒的大小是淀粉水解率的另一主要决定因素[26]，CVR组通过涡旋仪破碎形成的颗粒小于其他模拟口腔加工组，更利于酶的接触，因此CVR组体外模拟淀粉水解率高于CYR组。本研究结果显示，淀粉水解水平与粒径呈显著负相关(r=-0.934 94，P<0.05)。CVR处理的馒头与人工唾液混合更加均匀，更有利于α-淀粉酶与淀粉的接触，所以消化更彻底，更接近HM处理后的食团。

不同小写字母表示同一时间不同类别样品差异显著(P<0.05)。图5 不同体外模拟口腔加工后淀粉体外水解曲线Fig.5 In vitro hydrolysis curves of starch after different in vitro simulated oral processing

不同模拟口腔加工方法对不同消化速率淀粉的质量分数也有显著性影响，见图6。青稞馒头中，HM处理方法的RDS质量分数(40%)显著高于其余体外口腔加工方法(P<0.05)，RS质量分数(31%)显著低于其余体外口腔加工方法(P<0.05)；CVR处理仅RDS质量分数(32%)显著低于HM处理，而SDS质量分数(29%)和RS质量分数(38%)与HM处理组均无显著性差异，表明CVR处理是最接近真实口腔咀嚼状态的体外模拟方法。对于小麦馒头，CVR处理RDS质量分数(29%)接近HM处理方法的RDS质量分数(33%)，且显著高于其余模拟口腔加工方法(P<0.05)；通过CVR处理的SDS(51%)与HM组(52%)无显著差异。

不同小写字母表示同一时间不同类别样品差异显著(P<0.05)。图6 不同体外模拟口腔加工后不同淀粉组分的质量分数Fig.6 Mass fraction of different starch components after different in vitro simulated processing

2.3 体外模拟口腔加工对馒头体外淀粉消化动力学的影响

不同体外模拟口腔加工方法对青稞馒头和小麦馒头体外淀粉消化动力学的影响如表2、表3。各种体外口腔加工方法的最终水解率(C∞)相差较大，经过180 min水解后，CVR处理的青稞馒头中有65.34%±3.48%的淀粉被水解，与HM处理组72.23%±2.73%的淀粉水解率最为接近，而C处理只有38.37%±2.06%的淀粉被水解。k值越小说明淀粉的体外消化达到C∞的速度越慢[27]，淀粉样品中RS质量分数越高，其C∞的值越低。但是C∞与k的变化并不完全一致，其中青稞馒头的k值显著高于小麦馒头的k值，但其C∞却比小麦馒头的要低，表明青稞馒头早期的水解速率比小麦馒头快，但水解平衡时的水解率却低，最终导致青稞馒头的eGI显著低于小麦馒头。进一步分析发现，粒径与eGI成极显著负相关(r=-0.901 51,P<0.05)，这一趋势与淀粉消化率一致，表明机械破坏的方式和水平以及固体颗粒与唾液混合的方式都会影响食团形成[28]，进而影响馒头的消化动力学。

表2 青稞馒头淀粉体外模拟水解动力学方程的特征参数

表3 小麦馒头淀粉体外模拟水解动力学方程的特征参数

3 结 论

不同体外模拟口腔加工方式对馒头颗粒大小和物理性质有显著影响。CVR处理后馒头颗粒粒径小，浸渍效率高，导致淀粉水解率高，颗粒大小与淀粉水解率呈显著正相关。与C、CV、CY组相比，CVR组对团块结构的广泛破坏使淀粉在模拟胃肠道消化过程中水解得更快更彻底,也更贴近于体内口腔咀嚼。综合考量各指标，CVR这种体外模拟口腔加工方式最适合馒头类制品的体外模拟淀粉消化。考虑到口腔加工对淀粉基食品消化特性的显著影响，可在体外模拟淀粉消化实验过程中增加口腔前处理阶段。