5株枣果实采后病原真菌分离鉴定及rDNA ITS区序列分析

姚 婷， 丁凤兰， 王 珂， 马国为， 陈玉娟， 张 燕，何欣萌， 王友升,*

(1.北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心， 北京 100048； 2.日照市疾病预防控制中心， 山东 日照 276826； 3.山东凯普菲特生物科技有限公司 日照华伟大健康产业研究院，山东 日照 276801)

枣(ZiziphusjujubaMill.)属鼠李科枣属植物，落叶小乔木，是我国重要的传统特色果树[1]。我国新疆地区得天独厚的自然资源，造就枣果实卓越的品质，新疆红枣种植面积占全国红枣种植总面积的1/3[2]。新疆干制枣以从内地引进的富含氨基酸、蛋白质和各种活性物质的灰枣、骏枣等为主，鲜食品种以从山东引进我国独有的冬枣为主。冬枣果形美观、味道鲜美，富含人体所需的氨基酸和多种维生素， 同时含有多种微量元素和较多的药用成分，被誉为“活维生素丸”[2-3]。枣果实中含有cAMP和cGMP，对冠心病、心肌梗死等有辅助疗效[4-5]。枣果实的食用和商品价值极高，但果实皮薄、肉厚、细嫩多汁，不仅在采后运输中易失水软化造成品质下降和经济损失，而且采后极易腐烂变质，难以储存，这些问题严重制约了枣果实产业的发展。控制采后病害是延长枣果实货架期的关键点[6-7]。真菌和细菌可引起枣果实采后侵染性病害，而真菌性病害最为常见，主要涉及链格孢菌、青霉菌、茎点霉菌、根菌索菌、镰刀菌、根霉菌、曲霉菌、芽枝菌等12个属的真菌[8-9]。刘晓林等[10]对产生黑腐病的骏枣、灰枣和壶瓶枣进行研究，分离鉴定后发现链格孢菌为致病病原菌；沙娜瓦尔·色买提等[11-12]从发生霉烂病的骏枣、灰枣和哈密大枣中，发现了以黑曲霉为主要致病菌的曲霉属真菌和以波兰青霉为主要致病菌的青霉属真菌；还有研究表明，引起冬枣青腐病的病原真菌有橘青霉、扩展青霉[13-14]。此外，灰葡萄孢菌可引起冬枣在采后产生灰霉病[15]。尽管目前研究者对引起枣果实采后侵染性病害的病原菌已开展较多研究，然而枣果实采后侵染性病害依然制约着枣果实产业的发展[8]。对于引起骏枣、冬枣采后病害的其他病原真菌，国内外鲜有报道，是否存在对枣果实产生采后侵染性病害的其他病原真菌，需要开展进一步的研究。

真菌rDNA包含外部转录间隔区(external transcribed spacer，ETS)、18S基因、内部转录间隔区1(internal transcribed spacer，ITS1)、5.8S基因、内部转录间隔区2(internal transcribed spacer，ITS2)、 28S基因和基因间隔序列(intergenicspacer，IGS)[16]，保守性强，但不同菌株之间存在序列和长度多态性。运用ITS- 4和ITS-5扩增rDNA ITS区的内转录间隔区，可通过分析较短的rDNA ITS区序列信息，快速有效地对真菌进行分类鉴定[17-18]。本研究拟从采后自然发病的新疆冬枣和骏枣果实上分离得到丝状病原真菌，结合果实病症、形态学特征及rDNA ITS区序列分析结果，对枣果实的丝状病原真菌进行分析。希望鉴定出更多引起枣果实病害的病原真菌种类，为枣果实病害的生物防治措施的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与培养基

冬枣和骏枣果实采自新疆阿克苏地区有机果园，选择在室温下贮藏至发病的果实进行研究。

DNA分子质量标准2×Taq PCR Master Mix、Marker Ⅶ，购自天根生化试剂公司；通用引物ITS- 4和ITS-5由上海生工生物工程有限公司负责合成。三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸钠(EDTA)、十二烷基磺酸钠(SDS)，购自Amersco公司，乙醇、盐酸均为分析纯。

马铃薯培养基(PDA)：称取削皮后的马铃薯200 g，切片煮沸30 min后，过滤取汁液，加入琼脂粉18 g、葡萄糖20 g、加水补足至1 L，121 ℃灭菌20 min。麦芽浸粉培养基(ME)：麦芽浸粉20 g、琼脂粉18 g，调节pH值至5.5±0.2，121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

Forma ClassⅡA2型生物安全柜，美国Thermo Fisher Scientific公司；Axio Image A1型显微镜，德国Zeiss公司MG96+型PCR仪，杭州朗基科学仪器有限公司；CJ100型净化试验台，北京赛伯乐实验仪器有限公司；MJX- 250Ⅱ型霉菌培养箱，广东省医疗器械厂。

1.3 实验方法

1.3.1菌种的分离、纯化与回接

分离：取枣果实发病部位和健康组织交界处果肉，并将病斑一侧倒扣于PDA固体培养基平板上，25 ℃培养1～3 d。 纯化：扣取分离菌边缘菌块，分别三点转接到PDA和ME培养基平板上，于25 ℃培养14 d。回接：挑选健康无损伤的冬枣和骏枣果实，用体积分数为75%的乙醇溶液进行表面消毒，用无菌接种针刺孔，取纯化后的菌块接种至伤口处，观察果实接种处是否出现相应病症，并在病斑处再次分离病原菌，比较分离到的病原菌与接种病原菌的菌落形态[19]。

1.3.2菌落形态学观察

将纯化得到生长于PDA培养基上的菌落，从菌落外沿取菌块，分别三点转接到PDA和ME培养基平板上，于25 ℃培养14 d，分别观察菌落形态。于洁净载玻片上，滴1滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，将插片培养的盖玻片置染色液中，然后盖上盖玻片，置于显微镜下观察产生分生孢子及分生孢子梗的形状、色泽和分生孢子隔膜等性状[20-21]。

1.3.3基因组DNA的提取及rDNA ITS区序列分析

采用改良后的十二烷基硫酸钠(SDS)- 氯化苄法提取待鉴定菌株总DNA[22]。以ITS- 4和ITS-5为PCR扩增引物，PCR产物电泳检测结果与实验设计的目的片段大小相符后送至华大基因进行Sanger测序，测序结果在NCBI进行同源序列比对，选取相似度大于99%的同源序列进行分析，并且构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与回接结果分析

将采后贮藏过程中自然发病的冬枣和骏枣果实病斑及从果实上分离到的病原菌回接到健康无伤枣果实上，导致枣发病的病斑特征如图1所示。图1结果表明，枣果实中分离得到5株丝状病原真菌221#、227#、229#、230#和232#，纯化后回接到健康无伤的骏枣果实上，在接种部位均出现同样的病症，并能从该病害部位再次分离得到相应病原菌；因此，可确定为枣果实致病菌。

图1 5株病原真菌分离与回接时的病症Fig.1 Fruit symptoms of isolation fruits and re-inoculated fruits of five pathogenic fungi

2.2 病原菌的形态观察结果

2.2.1菌落形态分析

从采后贮藏过程中自然发病的冬枣和骏枣果实上分离得到的5株丝状病原真菌，经纯化后分别三点转接至PDA和ME固体培养基上，并于25 ℃条件下培养14 d，菌落形态如图2所示。图2结果表明，菌株221#在PDA培养基较ME培养基上生长旺盛，培养7d时菌落覆盖整个PDA板，菌丝呈白色、致密、棉絮状，菌落中央浅黄色[图2 (a1)]，相比而言ME板上菌丝较薄且菌丝较长、中央浅黄色[图2 (a2)]；培养14 d后，PDA板上的菌落颜色加深[图2 (a3)]， ME培养基上的菌落颜色也加深，整体呈浅黄色，但菌丝仍未铺满ME平板[图2 (a4)]。

菌株227#在PDA培养基上培养7 d时菌丝呈白色绒毛状，中央菌丝积聚形成突起[图2 (b1)]，而在ME培养基上菌落形状不规则、菌丝厚薄不一、边缘裂口[图2 (b2)]；培养14 d后，两种培养基上的菌落形态均没有发生明显改变[图2 (b3)和图2 (b4)]。

菌株229#在PDA和ME培养基上长势相近，培养7 d菌落表面干燥、边缘清晰，菌丝呈白色、绒毛状，有色素产生[图2 (c1)和图2 (c2)]；培养14 d后，PDA培养基上的菌落中央突起，出现较深的褶皱，由于色素的产生而导致培养基呈现深红色[图2 (c3)]，ME培养基上菌落同样出现突起，但不集中在中央，而是呈轮纹状分布，产生色素较少，培养基呈黄褐色[图2 (c2)和图2 (c4)]。

菌株230#在PDA和ME培养基上的生长速度较为缓慢，培养7 d时菌落边缘清晰、中央黏稠；边缘干燥呈明显的根状[图2 (d1)和图2 (d2)]；继续培养至14 d，PDA板菌落仍呈白色，ME板上菌落呈浅褐色，中央颜色较深，PDA板上黏稠部分较ME板上范围更大[图2 (d3)和图2 (d4)]。

菌株232#在PDA培养基上长势较ME培养基上旺盛，培养7 d时PDA板上菌落淡黄色、致密、绒毛状，有红褐色色素产生[图2 (e1)]，而ME板上的菌落则不产生色素，但菌落较PDA板更为致密、菌丝较短且菌落边缘清晰[图2 (e2)]；继续培养至14 d后， 两种培养基上菌丝均已满板，PDA板上色素含量显著增加、培养基呈深红褐色[图2 (e3)]，而ME培养基上菌落颜色不均一[图2 (e4)]。

图2 5株病原真菌在PDA和ME培养基25 ℃培养7 d和14 d的菌落特征Fig.2 Colony characteristics of five pathogenic fungi cultured on PDA and ME plates for 7 d and 14 d at 25 ℃

参考《真菌鉴定手册》等文献关于相关菌株的菌落及形态描述[20-21]，菌株221#和227#为镰孢菌，229#和232#为葡柄霉，230#为短柄霉属真菌。

2.2.2显微形态分析

从采后贮藏过程中自然发病的冬枣和骏枣果实上分离到的5株丝状病原真菌，接种在PDA固体培养基上，于25 ℃培养，显微镜下观察孢子及菌丝或孢子梗形态，结果如图3所示。由图3可以看出，菌株221#的菌丝着色较浅、分枝多且内部隔膜观察明显[图3(a2)]，孢子梗分枝明显、分生孢子狭长呈新镰刀状或弯月形[图3(a1)]；菌株227#的菌丝着色较浅、分枝多且内部隔膜观察明显[图3(b2)]，分生孢子椭圆形、孢子壁光滑[图3(b1)]；菌株229#在PDA板上培养14 d后有孢子产生，菌丝着色较深、分枝多且内部隔膜观察明显[图3(c1)和图3(c2)]；菌株230#呈现两种显微形态：单细胞个体和菌丝，单细胞呈椭圆形，菌丝体具隔[图3(d1)和图3(d2)]；菌232#菌株的孢子暗褐色、形状不规则、表面粗糙、有壁砖状分隔[图3(e1)]，菌丝着色较浅、分枝多且内部隔膜观察明显[图3(e2)]。

图3 5株病原真菌的显微形态观察结果Fig.3 Micromorphological characteristics of five pathogenic fungi

2.3 rDNA ITS区序列分析及系统进化树构建

采用改良后的SDS-氯化苄方法提取总DNA，本研究所提取的基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检测未出现降解，提取质量较好。以基因组DNA为模板，ITS- 4和ITS-5为引物，经PCR扩增得到 rDNA ITS区目的片段，PCR产物电泳检测结果如图4所示。图4结果表明，221#菌株[图(4 a)]、227#菌株[图(4b)]、229#菌株[图(4c)]、230#菌株[图(4d)]和232#菌株[图(4e)]目的条带在600 bp左右。

图4 5株病原真菌的rDNA ITS区PCR产物电泳分析Fig.4 Electrophoresis results of rDNA ITS PCR product of five pathogenic fungi

图5 以rDNA ITS区序列为分子标记的5株病原真菌系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of five pathogenic fungi strains based on rDNA ITS sequence as molecular marker

真菌rDNA ITS区具有序列长度和碱基排列多态性，同源性分析并且构建系统进化树如图5所示。由图5结果可知：221#与木贼镰孢菌(Fusariumequiseti)在同一分枝上，亲缘距离小于0.05，该结果置信度达99%[图5(a)]；227#与变红镰孢菌(Fusa-riumincarnatum)在同一分枝上，亲缘距离小于0.05，置信度达95%[图5(b)]；229#与番茄匍柄霉(Stemphyliumlycopersici)在同一分枝上，亲缘距离为零，置信度达99%[图5(c)]；230#与产酶短梗霉(Aureobasidiumproteae)在同一分枝上，亲缘距离为零，置信度达99%[图5(d)]；232#与葡柄霉(Stemphyliumarmeriae)在同一分枝上，亲缘距离小于0.05，置信度达94%[图5(e)]。因此rDNA ITS区鉴定221#为木贼镰孢菌(F.equiseti)，227#为变红镰孢菌(F.incarnatum)，229#为番茄匍柄霉(S.lycopersici)，230#为产酶短梗霉(A.proteae)，232#为葡柄霉(S.armeriae)。

3 讨 论

据报道，枣果实常见的病害有噬枣欧文氏细菌引起的缩果病，真菌性病害有小穴壳菌引起的褐斑病，盘长孢状炭疽菌引起的蕉叶病，镰孢菌引起的蒂腐病，链格孢或毁灭茎点霉或壳梭孢属引起的铁皮病，以及由炭疽菌、镰孢菌、茎点霉和链格孢等多种真菌侵入引起的烂果病[23-24]。

镰刀菌是葡萄、华莱士瓜等水果常见病原真菌[25-26]，有研究者从枣果实上分离到尖孢镰刀菌(F.oxysporum)，证实该菌可导致枣软果腐病或导致烂果[27-28]。本研究从采后贮藏期间枣果实上分离的221#木贼镰刀菌(F.equiseti)和227#变红镰孢菌(F.incarnatum)同样会导致枣果实软化并腐烂，但目前未见到这两种菌侵染枣果实的报道。因此，本研究分离到了两株引起枣果实采后病害的镰刀菌，希望为该属真菌对宿主营养物质的需求及其代谢网络调控机制的研究提供新思路。

短柄霉属病原菌可以侵染果实，引起果实采后病害。有研究从葡萄和枣果实上分离得到出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，证实该菌可导致果实腐烂[29-30]。本研究从枣果实上分离到1株产酶短梗霉230#(A.proteae)，该菌已有导致小麦赤霉病的报道[31]，但其引起的水果采后病害情况鲜有报道，尤其是该菌引起枣果实采后贮藏过程中的病害未见报道。

本研究分离到的229#番茄匍柄霉(S.lycopersici)可导致番茄和芦笋等叶斑病[32-33]，而目前未见该种菌可侵染枣果实导致枣采后病害发生的报道。目前未见菌株232#葡柄霉(S.armeriae)引起的植物病害的报道，尤其是引起果蔬采后病害的报道。

4 结 论

本研究从采自新疆阿克苏地区的冬枣和骏枣果实上分离得到5株丝状病原真菌。结合5株丝状真菌形态学特征及rDNA ITS区序列进化树分析结果，确定病原菌221#为木贼镰孢菌(F.equiseti)、227#为变红镰孢菌(F.incarnatum)、229#为番茄匍柄霉(S.lycopersici)、230#为产酶短梗霉(A.proteae)和232#为葡柄霉(S.armeriae)，目前这5种菌均未发现可导致枣采后病害发生的报道，其中S.armeriae未见引起的植物病害的报道。本研究在采后侵染性病害的枣果实中发现了文献未见报道的5株丝状真菌，希望本研究结果可为新疆枣果实病害的有效防治提供进一步的参考。