基于转录组学分析日本沼虾原肌球蛋白对小鼠巨噬细胞极化的影响

胡 昕， 骆叶晴， 孙耀斌， 陈红兵， 谢彦海,*

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室， 江西 南昌 330047；2.南昌大学 食品学院， 江西 南昌 330047； 3.南昌大学 中德联合研究院， 江西 南昌 330047)

食物过敏是由于接触或摄入食物引起的异常免疫反应[1]。水产品过敏是最常见的食物过敏之一，其中八大类过敏食物中水产品就占两大类，即鱼类和甲壳类[2]。我国水产品生产量和消费量位于世界前列，2020年我国水产品总产量达到6 549.0万t[3]，但随着水产品消费量的逐年增加，尤其是甲壳类水产品引起的食物过敏问题愈加突出。日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)，俗称河虾，是我国常见食用淡水虾之一。日本沼虾体内的原肌球蛋白(tropomyosin, TM)为虾蟹类的泛过敏原蛋白，易引起部分敏感人群产生过敏反应[4]。

巨噬细胞是固有免疫系统中的重要组成部分，在机体免疫中发挥重要作用[5]。巨噬细胞极化是指在不同因素诱导下巨噬细胞呈现出不同的表型与功能[6]。激活后的巨噬细胞表型一般分为2种：经典激活途径M1型和替代激活途径M2型[7]。M1型巨噬细胞通常由TLR配体如脂多糖(LPS)和细胞因子如干扰素- γ(IFN- γ)等刺激产生，具有高抗原提呈能力和促炎效果，在宿主抵抗感染中起关键作用[8]。M2型巨噬细胞通常由细胞因子IL- 4、IL- 10和IL- 13等刺激产生，具有抗炎和免疫调节功能[9]。

巨噬细胞与食物过敏的关系至今不清晰，有研究表明巨噬细胞或参与食物过敏反应。在IFN- γ的作用下，巨噬细胞可发挥专职抗原提呈细胞(APC)功能，巨噬细胞表达的MHC Ⅰ和Ⅱ类分子水平显著升高，可提呈抗原肽- MHC Ⅱ类分子复合物给CD4+T细胞，参与食物过敏反应[5]。食物过敏反应主要为IgE介导，巨噬细胞高表达IgE低亲和力特异性受体FcεRII，可能通过FcεRII受体参与减轻或降低过敏现象，还可能在食物过敏原的口服耐受中起重要作用[10]。巨噬细胞是肺中最丰富的免疫细胞，在致敏原诱导的哮喘气道炎症中十分重要，因此可以猜测巨噬细胞在食物过敏起到一定的作用[11]。在中国龙虾和卵清蛋白食物过敏小鼠模型中，实验发现2组过敏小鼠肺部出现炎症性改变，炎症细胞浸润中包含大量巨噬细胞[12]。巨噬细胞表达的 DC- SIGN和TIM- 4可能诱导食物过敏反应产生特异性IgE[13]。Kim等[14]在卵清蛋白致敏小鼠模型中发现CHI3L1促进Th2相关炎症反应和M2型巨噬细胞极化，进而影响食物过敏的发展进程。但巨噬细胞极化与水产品过敏的相关机制还不明确，本研究为了解原肌球蛋白与巨噬细胞极化间的作用机制，对原肌球蛋白和细胞因子刺激后的小鼠巨噬细胞进行高通量测序，筛选差异基因和相关信号通路。最后利用荧光定量PCR验证信号通路中关键基因的变化，了解原肌球蛋白参与巨噬细胞极化调节的相关通路，为进一步研究巨噬细胞极化与食物过敏的关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雄性BALB/c小鼠，6～7周龄，18～20 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)2019- 0004。动物实验已得到南昌大学医学实验动物伦理委员会批准。

IMDM培养基、胎牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸钠、100×青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、50 mmol/L β-巯基乙醇，美国Gibco公司；LPS、IL- 4、IFN- γ、Tri-zol，美国Invitrogen公司；HiScript III RT SuperMix反转录试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Applied Biosystems Quant Studio TM3型实时荧光PCR仪、NanoDrop ONEC型超微量核酸蛋白测定仪，美国 Thermo Fisher公司；CKX41 型倒置荧光显微镜，日本 Olympus 公司。Nova Seq6000型测序平台，美国Illumina公司。

1.3 实验方法

1.3.1日本沼虾原肌球蛋白的提取纯化

将新鲜日本沼虾虾肉捣碎，预冷丙酮除脂，室温下风干沉淀得到丙酮粉，溶于0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)(pH 值7.4)中搅拌12 h，离心(10 000 r/min、30 min、4 ℃)取上清液。用硫酸铵(277 g/L)盐析蛋白粗提液，硫酸铵全部溶解后继续搅拌30 min。离心(10 000 r/min、30 min、4 ℃)取沉淀，沉淀用10 mL 0.02 mol/L Tris- HCl(pH值8.0)复溶，沸水浴加热10 min后离心(10 000 r/min、30 min、4 ℃)，上清液用于层析柱上样。

阴离子交换层析柱(DEAE- Sepharose)纯化原肌球蛋白：20 mmol/L Tris- HCl缓冲液(pH值8.0)充分平衡后上样，20 mmol/L Tris- HCl缓冲液(pH值8.0)洗脱未结合柱材的杂质，进行梯度洗脱(含0.8 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris- HCl缓冲液，pH值8.0)，280 nm处检测吸光度，流速1.5 mL/min，收集对应洗脱峰的洗脱液，经SDS- PAGE和质谱分析鉴定为原肌球蛋白。将原肌球蛋白除盐浓缩，置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2小鼠骨髓源巨噬细胞培养

1.3 统计学分析 采用EpiData 3.1软件录入数据，应用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以（±s）表示，两组间比较分析采用t检验，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

小鼠麻醉后脱颈处死，体积分数75%酒精浸泡5 min，分离大腿股骨和胫骨，用注射器吸5 mL BMDM培养基(100 mL IMDM培养基、10 mL胎牛血清、1 mL双抗、1 mL 非必需氨基酸、1 mL丙酮酸钠、30 mL L929细胞上清液)冲洗骨髓腔，再用注射器吸取培养基反复吹打骨髓，使细胞均匀分散，补充培养基至20 mL后，将细胞转移到37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，3 d后再加入10 mL BMDM培养基，继续培养4 d，第7天收集细胞。

1.3.3原肌球蛋白诱导小鼠骨髓源巨噬细胞极化

将巨噬细胞接种至6孔板(细胞量2.5×106个/孔)，分为PBS组(PBS对照组)、TM组(原肌球蛋白诱导组)、LPSIFN组(LPS和 IFN- γ联合诱导M1型巨噬细胞组)、IL4组(IL- 4诱导M2型巨噬细胞组)共4组。将6孔板置于37 ℃、5% CO2培养箱培养12 h。随后向TM组培养基中加入原肌球蛋白(终质量浓度为10 μg/mL)，其他组加入等体积PBS，继续培养12 h，接着向LPSIFN组培养基中加入LPS(终质量浓度为100 ng/mL)和IFN- γ(终质量浓度为20 ng/mL)，IL4组培养基中加入IL- 4(终质量浓度为20 ng/mL)，其他组加入等体积PBS，继续培养24 h，分别诱导骨髓源巨噬细胞极化为M1型和M2型。诱导结束后收集细胞用于转录组测序。

1.3.4转录组测序

收集诱导后的细胞，加入Trizol溶液，放入液氮速冻。样品合格的标准为OD260/280=1.8～2.2、OD260/230≥2.0、RNA 完整值(RIN)≥7.0、28S/18S≥1.0、总量>1 μg。RNA提取及测序过程由上海派森诺生物科技有限公司完成，经Illumina NovaSeq6000测序平台得到原始数据，数据过滤后用于后续软件和数据库分析。

1.3.5巨噬细胞总RNA的提取

用1.3.3方法诱导骨髓源巨噬细胞极化。离心收集细胞，用PBS清洗2次，加入1 mL Trizol吹打后加入200 μL氯仿，涡旋15 s，静置3 min后离心(12 000 r/min、15 min、4 ℃)。吸取上清液，加入等量异丙醇后混匀，静置10 min后离心(12 000 r/min、10 min、4 ℃)。弃上清液，加入体积分数75%乙醇重悬，离心(7 500 r/min、10 min、4 ℃)后弃上清液，重复1次。加入无核酶ddH2O溶解RNA沉淀。RNA的质量和完整性用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳和OD260/280值来评价。最后用HiScript Ⅲ RT SuperMix试剂盒将RNA反转录成cDNA，具体步骤参考试剂盒说明书。

1.3.6荧光定量PCR验证

根据高通量测序结果初步筛选出巨噬细胞极化可能的信号通路，如NOD样受体信号通路、Jak- STAT 信号通路、NF- κB信号通路、Toll样受体信号通路、PI3K/Akt信号通路。利用荧光定量PCR技术验证信号通路中关键基因的表达。反应体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，无菌ddH2O 7.2 μL。反应条件：95 ℃、30 s，40个循环反应(95 ℃、 10 s，60 ℃、 30 s)。β-actin为内参基因，所有荧光定量引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用2-ΔΔCT方法来计算基因的相对表达量。

表1 引物序列信息

1.4 数据处理

数据应用Graphpad Prism 8.0软件进行统计学计算及绘图。P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 测序质量分析

对PBS组、TM组、IL4组、LPSIFN组共12个样品进行转录组测序，获得原始数据(碱基数)和过滤后的数据，数据质量见表2。Q20(碱基识别准确率在99%以上的碱基占比)最低值为96.09%，Q30(碱基识别准确率在99.9%以上的碱基占比)最低值为91.01%，均大于90%，证明样品转录组测序质量较好，测序数据可进行后续分析。

表2 样本数据整理及测序质量

2.2 表达量分析

样品表达水平相关性是衡量实验结果可靠性的重要指标之一，采用皮尔逊相关系数表示样品间基因的表达水平相关性，相关系数越接近1，表明样品间表达水平相关性越高。样品基因表达水平相关性分析见图1。同组样品的相关系数均大于0.90，证明样品间相似度高，数据具有可靠性。

图1 样品基因表达水平相关性Fig.1 Correlation of gene expression levels among samples

2.3 基因表达差异分析

对TM组、IL4组、LPSIFN组巨噬细胞的基因表达与PBS组进行差异分析，基因表达差异重叠结果如图2，共有17个相同差异基因。与PBS组相比，差异基因最多的为LPSIFN组。根据表达差异倍数大于1，P<0.05的标准筛选差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)，绘制差异基因统计图(图3)。在显著差异基因比对中，PBS组与LPSIFN组共有2 379个显著差异基因，LPSIFN组上调1 151个基因，下调1 228个基因。PBS组与IL4组共有556个显著差异基因，IL4组上调298个基因，下调258个基因。IL4组与LPSIFN组共有2 440个显著差异基因，LPSIFN组上调1 255个基因，下调1 185个基因，表明：M1型与M2型巨噬细胞之间存在大量的DEGs，其中M1型巨噬细胞标志基因iNOS、Fpr2在LPSIFN组中显著上调，M2型巨噬细胞标志基因Arg、Egr2显著下调，印证了诱导方法的正确性。TM刺激后，与PBS组相比，TM组上调69个基因，下调154个基因。TM组与IL4组共有901个差异基因，TM组上调455个基因，下调446个基因。TM组与LPSIFN组共有2 706个差异基因，TM组上调1 346个基因，下调1 360个基因。

图2 差异表达基因韦恩图Fig.2 Venn diagram of differentially expressed genes

图3 不同组间显著差异表达基因统计Fig.3 Statistics of expressed genes with significant differences between different groups

2.4 差异表达基因GO通路富集分析

GO(gene ontology)分析是一个国际标准化的基因功能分类体系，可以全面描述生物体中基因和基因产物的属性。GO分析涵盖3方面：细胞组分(cellular component, CC)、生物学功能(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)。对DEGs进行GO富集分析，结果均包含3种类别，但主要以生物学功能为主。

显著性高的前20个基因功能分类如图4。对不同极化巨噬细胞进行分析，IL4组与LPSIFN组[图4(a)]基因功能分类均为生物学功能，主要涉及免疫系统过程、防御反应、免疫反应等，证实了不同极化表型的巨噬细胞在免疫功能方面具有一定差异。PBS组与TM组[图4(b)]注释到的细胞组分主要为细胞外基质、胞外区，生物学功能主要为细胞分化、细胞表面受体信号通路、细胞发育过程等，分子功能为蛋白质结合。LPSIFN组与TM组[图4(c)]注释到的生物学功能较多，涉及免疫反应、对外部刺激的调节、炎症反应等，在分子功能方面，差异基因主要参与蛋白质结合过程。IL4组与TM组[图4(d)]注释到的生物学功能主要与细胞增殖相关，包括细胞周期、细胞分裂、基因复制等，分子功能注释到蛋白质结合等。

图4 GO通路富集差异基因分析Fig.4 GO pathway enrichment analysis of differential genes

2.5 差异表达基因KEGG通路富集分析

KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)是整合了基因组、化学、系统功能信息的数据库，可对代谢通路进行注释。

为确定巨噬细胞极化的相关途径，对4组样品差异基因进行KEGG富集分析，见图5。IL4组和LPSIFN组[图5(a)]，共富集到306条通路，主要属于人类疾病、细胞过程、生物体系统、环境信息加工。306条通路中与炎症和免疫应答相关的通路包括抗原加工和呈递、NOD样受体信号通路、Jak- STAT 信号通路、细胞因子- 细胞因子受体相互作用、NF- κB信号通路、Toll样受体信号通路、PI3K/Akt信号通路、TNF信号通路等。

PBS组与TM组[图5(b)]差异基因KEGG通路富集分析得到180条通路，排名前20的通路主要属于人类疾病、细胞过程、生物体系统、新陈代谢、环境信息加工，涉及氨基酸代谢、细胞黏附、糖脂类通路、MAPK信号通路等通路。LPSIFN组与TM组[图5(c)]KEGG通路富集分析得到308条通路，排名前20的通路属于人类疾病、细胞过程、生物体系统、新陈代谢，308条通路中与免疫反应相关通路包括抗原加工和呈递、TNF信号通路、细胞因子- 细胞因子受体相互作用、 Jak- STAT 信号通路、NF- κB信号通路、Toll样受体信号通路、PI3K/Akt信号通路等。IL4组与TM组[图5(d)]KEGG通路富集分析得到269条通路，排名前20的通路属于人类疾病、细胞过程、生物体系统、基因信息处理、环境信息加工，其中细胞因子- 细胞因子受体相互作用、Jak- STAT信号通路、趋化因子信号通路、NF- κB信号通路、NOD样受体信号通路等与免疫反应相关。

图5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 巨噬细胞极化信号通路中关键基因的验证

为验证转录组测序结果的准确性和推测巨噬细胞极化与原肌球蛋白的关系，根据通路富集结果，选择NOD样受体信号通路、Jak- STAT 信号通路、NF- κB信号通路、Toll样受体信号通路、PI3K/Akt信号通路5条相关通路，对这5条通路中具有显著性差异的关键基因NOD2、TLR2、AKT3、NLRP3、Caspase- 1、CD14、Lat、Myd88、NFKBIA、STAT1进行荧光定量PCR验证，结果见图6。由图6可知，基因变化趋势与测序结果基本一致。与PBS组和IL4组相比，LPSIFN组中NOD2、TLR2、AKT3、NLRP3、Caspase- 1、CD14、Myd88、NFKBIA、STAT1的相对表达量显著升高，Lat的相对表达量显著下降。TM组NOD2、TLR2、NLRP3、STAT1的相对表达量相较于PBS组显著增加，其余基因变化无显著差异。此外，结果还证实LPS、IFN- γ和TM联合刺激后NOD2、TLR2相对表达量显著增加，而AKT3、Myd88、NFKBIA、STAT1的相对表达量上升但不显著。初步推测原肌球蛋白可能通过NOD样受体信号通路、Jak- STAT信号通路和Toll样受体信号通路调节M1型巨噬细胞的极化。在IL- 4和TM联合刺激后TLR2相对表达量显著升高，NOD2、AKT3、NLRP3、Caspase- 1、CD14、Lat的相对表达量降低，Myd88、STAT1相对表达量升高，但不存在显著性差异。初步预测原肌球蛋白可能通过Toll样信号通路调节M2型巨噬细胞的极化。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。图6 荧光定量PCR基因验证结果Fig.6 Fluorescence quantitative PCR of gene verification results

3 讨 论

食物过敏是一个多因素影响的免疫反应，涉及固有免疫和适应性免疫应答，但巨噬细胞在固有免疫反应中的作用尚不明确。巨噬细胞的极化特性反映其功能的多变，本研究选择日本沼虾原肌球蛋白作为致敏原刺激巨噬细胞，从转录组学水平研究原肌球蛋白和不同细胞因子诱导巨噬细胞极化的基因表达差异。

TM组和PBS组进行差异基因比对，发现这些差异基因主要富集到细胞黏附、氨基酸代谢等通路。细胞黏附因子是介导细胞间或细胞外基质间结合的一种蛋白质分子，与炎症反应密切相关[15]。氨基酸的代谢可影响巨噬细胞的功能，同型半胱氨酸是甲硫氨酸与蛋氨酸代谢的中间产物，促进巨噬细胞释放炎症因子，使其向M1型巨噬细胞转化[16]。SLAMF9、Macro、Fpr2属于TM组与PBS组的差异基因，在TM组显著上调，与M1型巨噬细胞表达趋势一致。SLAMF9共同调控LPS诱导且由巨噬细胞介导的肝脏炎症[17]。习大林等[18]等沉默巨噬细胞中Macro基因后巨噬细胞吞噬细菌能力降低，Macro在TM组上调表明TM或可增强巨噬细胞吞噬能力。Fpr2是新的M1型巨噬细胞标志基因[19]，Fpr2在IL4组下调，LPSIFN组和TM组上调。

M1与M2型巨噬细胞差异基因的KEGG富集分析发现，其主要涉及的免疫相关通路有NOD样受体信号通路、Jak- STAT 信号通路、NF- κB信号通路、Toll样受体信号通路和PI3K/Akt信号通路等，这些通路均与巨噬细胞极化相关。TM组与IL4组、TM组与LPSIFN组富集到的通路较多，其中包含这5条免疫相关通路。原肌球蛋白刺激巨噬细胞后NOD2、TLR2、NLRP3、STAT1基因表达量显著增加。LPS、IFN- γ和TM联合刺激后NOD2、TLR2基因表达量显著增加，IL- 4和TM联合刺激后TLR2基因表达量显著升高。TLR2是固有免疫反应中的一个重要因子，可促进M1型巨噬细胞的极化，TLR2拮抗剂cu- cpt22可将LPS体外诱导的M1型巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞[20]。Jak- STAT 信号通路可与Toll样受体信号通路中的TLR相互作用，共同调控M1型巨噬细胞极化和炎症反应[21]。STAT1是一种非常重要的转录因子，可以促进M1型巨噬细胞极化，Zhu等[22]证实 miR- 19a- 3p靶向作用于STAT1，下调STAT1的表达，抑制M1型巨噬细胞极化。

4 结 论

本研究用荧光定量验证了与巨噬细胞极化相关的NOD样受体信号通路、Jak- STAT 信号通路、NF- κB信号通路、Toll样受体信号通路和PI3K/Akt信号通路表达差异关键基因的表达，结果发现与M2型巨噬细胞相比，M1型巨噬细胞中NOD2、TLR2、AKT3、NLRP3、Caspase- 1、CD14、Mdy88、NFKBIA和STAT1基因的表达增高，而Lat基因表达下降。与PBS组相比，当巨噬细胞中加入原肌球蛋白后，NOD2、TLR2、NLRP3、STAT1这4个基因具有显著差异性，LPS、IFN- γ和TM联合刺激和IL- 4和TM联合刺激巨噬细胞后，TLR2表达量均显著上升，表明原肌球蛋白可能通过NOD样受体信号通路、Jak- STAT 信号通路和Toll样信号通路调节M1型巨噬细胞极化，但仍需要更多的研究来证明。巨噬细胞的M1/M2型极化并不是严格意义上的2种极端，在某些环境中，巨噬细胞可以表现为混合表型，具有与M1和M2型相似的特征[23-24]。M1与M2表型的动态变化与某些疾病状况的发展有关，例如肿瘤、骨关节炎等[25]，因此下一步研究将重点关注不同时间段原肌球蛋白刺激巨噬细胞极化的变化。