葡萄籽粗多糖的体内外抗氧化作用

裴晋红， 栗学清， 张建斌， 卫星星， 汪军梅

(1.山西长治医学院 生物化学教研室， 山西 长治 046099；2.山西长治医学院 职业与环境卫生学教研室， 山西 长治 046099；3.山西长治医学院 化学教研室， 山西 长治 046099)

多糖是一类普遍存在于生物体的活性物质，具有抗氧化[1]、抗肿瘤[2]、免疫增强[3]、降血糖[4]、降血脂[5]等生物学功能，临床上被用于治疗多种疾病。多糖的抗氧化性与其抗肿瘤、抗炎、降血糖、降血脂等功能密切相关，因此对其抗氧化性的研究有助于阐明多糖多种生理功能的作用机理。

氧化应激是导致细胞结构及功能损伤的重要原因，越来越多的研究证实许多植物提取物具有很强的抗氧化活性，可对抗细胞氧化应激[6]。研究表明：葡萄籽含有多种成分，如不饱和脂肪酸[7-8]、多糖[9]、原花青素[10]等，具有抗肿瘤[11]、抗氧化[12]、抗炎[8]、降血压[13]等多种功能。

葡萄籽作为葡萄制品的副产物，不但污染环境且造成资源浪费，因此，对葡萄籽进行开发和利用具有重要意义。目前对葡萄籽的研究较多集中在葡萄籽油和原花青素的生理功能上，也有部分学者对葡萄籽粗多糖(crude polysaccharides from grape seeds,GSCPs)的抗氧化性进行了研究，但仅停留在体外，对其体内抗氧化活性鲜有报道。

本研究利用水提醇沉法从葡萄籽中提取粗多糖，检测其对DPPH自由基、羟自由基清除作用及对DNA氧化损伤的抑制作用；在细胞水平研究GSCPs对H2O2诱导的氧化损伤RAW 264.7巨噬细胞的保护作用；以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans，C.elegans)为模式生物，分别检测GSCPs对其寿命、抗急性氧化应激能力及体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的影响。本研究从细胞外、细胞内及动物水平多角度对GSCPs的抗氧化活性进行研究，旨在为多糖的其他生理功能的深入研究奠定理论基础，为葡萄籽的开发及综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄籽，市售巨峰葡萄制作葡萄酒后的副产物；RAW 264.7巨噬细胞，中国科学院上海生命科学院；大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)OP50、N2野生型秀丽隐杆线虫(C.elegansBristolN2)，长治医学院生物实验室保存；SOD检测试剂盒、GSH- Px检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；活性氧检测试剂盒、CCK8(cell counting kit 8)试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；PUC18质粒，北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清、RPMI1640培养基，美国Gibco公司；维生素C、邻菲罗啉、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)，美国sigma公司；NGM培养基，美国MyBioSource公司；线虫 M9 缓冲液，赫澎生物上海科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DMI 3000 B型倒置荧光显微镜，德国Leica公司；Sunrise- Basic型酶标仪，瑞士Tecan公司；DP/N- 2100型旋转蒸发仪，北京亚欧德鹏科技有限公司；BJPX- 150型生化培养箱，山东博科科学仪器有限公司；Amicon Ultra- 15型超滤管，美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1GSCPs的制备

取适量葡萄籽冷冻干燥，粉碎后过60目筛，经石油醚脱脂，热水浸提(65 ℃，6 h)，减压浓缩、Sevag法脱蛋白、双蒸水过夜透析，醇沉(加入4倍的体积分数为95%的乙醇)，将粗多糖沉淀用蒸馏水复溶后，装入截留相对分子质量为3 000 Da的超滤管中，在上层多糖溶液中反复加入蒸馏水进行超滤，之后将超滤管上层溶液进行冷冻干燥后制得GSCPs，用于后续抗氧化实验。

1.3.2GSCPs对DPPH自由基清除作用的检测

GSCPs对DPPH自由基清除率的检测参考文献[14]稍作改动。分别取30 μL质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的GSCPs样品，将150 μL浓度为60 μmol/L的DPPH溶液加入其中(DPPH溶液以体积分数为95%的乙醇配制)，室温密封避光反应1 h，517 nm处测吸光度值，每组重复3次，以维生素C作为阳性对照，按照式(1)计算DPPH自由基清除率。

(1)

式(1)中，As为实验组吸光度值，Ab是DPPH被体积分数为95%的乙醇替代后的吸光度值，Ac为样品被双蒸水替代后的吸光度值。

1.3.3GSCPs对羟自由基清除作用的检测

GSCPs对羟自由基清除率的检测参考文献[14]进行。40 μL FeSO4(浓度为2 mmol/L)中加入40 μL邻菲罗啉(浓度为2 mmol/L)，再分别加入质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL多糖样品80 μL，之后加入40 μL H2O2启动反应(H2O2体积分数为0.03%)，37 ℃中孵育1 h，536 nm处测吸光度值，每组重复3次。按照式(2)计算清除率。

(2)

式(2)中，Am为实验组吸光度值，An是多糖被双蒸水替代后的吸光度值，Ak是H2O2被双蒸水代替后的吸光度值。

1.3.4GSCPs对DNA氧化损伤抑制作用的检测

DNA氧化损伤抑制实验参考文献[15]进行。实验设置样品组、损伤组和无损伤组。样品组：取8 μL PUC18质粒DNA，加入2 μL FeSO4(浓度为2 mmol/L)与8 μL多糖样品(质量浓度为0.2 mg/mL)，混匀后，加入2 μL H2O2启动反应(H2O2浓度为0.1 mmol/L)；损伤组：取8 μL PUC18质粒DNA，加入2 μL FeSO4(浓度为2 mmol/L)与8 μL双蒸水，混匀后，加入2 μL H2O2启动反应(H2O2浓度为0.1 mmol/L)；无损伤组：8 μL PUC18质粒DNA。将各组样品置于37 ℃水浴中保温10 min，以质量浓度为10 g/L琼脂糖凝电泳进行分析。

1.3.5RAW 264.7巨噬细胞活力的检测

用细胞增殖实验检测RAW 264.7巨噬细胞的活力。

含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中接种RAW 264.7巨噬细胞，37 ℃，体积分数为5%的CO2培养至细胞愈合度约80%～90%，以质量浓度为2.5 g/L胰蛋白酶消化。

96孔板中接种巨噬细胞(细胞密度为2×105个/mL)200 μL，培养24 h，将培养基弃去，加入含不同质量浓度GSCPs(0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL)的培养基，对照组培养基中不加多糖，各浓度分别设3个复孔，继续培养24 h，加Cell Counting Kit- 8(CCK8)溶液后再培养3 h，450 nm处测吸光度，以式(3)计算细胞的存活率。

(3)

1.3.6RAW 264.7巨噬细胞内ROS水平的检测

本研究团队前期已建立RAW 264.7巨噬细胞氧化损伤模型，根据前期实验结果，选择浓度为0.2 mmol/L的H2O2诱导细胞的氧化损伤。

6孔板中接种RAW 264.7巨噬细胞，细胞密度为2×105个/mL。以无血清培养液培养细胞24 h，分别设置对照组(含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基)、H2O2组(在含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中加入H2O2，使其终浓度为0.2 mmol/L)、H2O2+GSCPs组(在含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中加入H2O2使其终浓度为0.2 mmol/L，同时加入GSCPs，使其质量浓度达到0.2 mg/mL)，继续培养24 h。用无血清细胞培养液以体积比1∶1 000稀释DCFH- DA探针，使其终浓度为10 μmol/L，之后在每孔中加入稀释好的探针1 mL，37 ℃避光保温40 min。用pH=7.4的PBS洗涤细胞3次，于倒置荧光显微镜下观察。

1.3.7RAW 264.7巨噬细胞内抗氧化酶活性的测定

6孔板中接种密度为2×105个/mL的RAW 264.7巨噬细胞，无血清培养液培养24 h，分别设置对照组(含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基)、H2O2组(在含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中加入H2O2，使其终浓度为0.2 mmol/L)、H2O2+GSCPs组(在含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中加入H2O2使其终浓度为0.2 mmol/L，同时加入GSCPs，使其质量浓度达到0.2 mg/mL)，继续培养24 h。收集细胞，加裂解液，冰浴30 min，4 ℃离心15 min(12 000 r/min)，检测GSH- Px和SOD活性(检测方法参照剂盒说明书)。

1.3.8秀丽隐杆线虫寿命的测定

秀丽隐杆线虫寿命的测定参考文献[16]进行。同期化培养秀丽隐杆线虫至L2期，将线虫分别挑至含质量浓度为0、0.2、0.4、0.8 mg/mL GSCPs的OP50 NGM培养板中，计为第1天。之后每天在固定时间将存活的线虫挑至新平板中，记录存活的线虫数，到线虫全部死亡为止。每组线虫取30条，重复3次。

1.3.9秀丽隐杆线虫急性氧化应激的测定

秀丽隐杆线虫急性氧化应激测定参考文献[17]进行。取同期化虫卵分别在含有质量浓度为0、0.2、0.4、0.8 mg/mL的GSCPs的培养板上培养72 h，将线虫挑至含有6 mmol/L H2O2的M9溶液中，隔1 h记录一次存活的线虫数，至线虫全部死亡为止。每组线虫30条，重复3次。

1.3.10秀丽隐杆线虫体内ROS水平的测定

秀丽隐杆线虫体内ROS的测定参考文献[18]进行。采用ROS- 敏感染料DCFH- DA检测不同浓度GSCPs对线虫ROS水平的影响。线虫同期化培养至成虫，分别在含有质量浓度为0、0.2、0.4、0.8 mg/mL的GSCPs的培养板上培养48 h，用M9缓冲液将线虫洗下并转移至1.5 mL离心管中，用含有20 μmmol/L DCFH- DA的M9缓冲液20 ℃温浴30 min，离心后去除上清液，M9缓冲液反复洗涤3次，用200 μL M9缓冲液重悬，转移到96孔黑色酶标板中，在激发光和发射光波长分别为485 nm和535 nm条件下进行检测。

1.4 数据统计分析

所有实验重复3次，应用SPSS 17.0统计软件分析，数据均以平均值±标准差表示，分析方法为t检验和方差分析，P<0.05为显著差异。

2 结果与分析

2.1 GSCPs对DPPH自由基和羟自由基的清除作用

图1为GSCPs对DPPH自由基和羟自由基清除作用的检测结果，通过GSCPs对DPPH自由基和羟自由基的清除能力确定其抗氧化活性。DPPH是一种稳定的自由基，当自由基清除剂存在时，由于其自由基清除作用可使DPPH紫色消退，其最大吸收波长517 nm处测吸光度值减小。由图1(a)可知，随着GSCPs浓度的升高，对DPPH的清除能力逐渐增加，当质量浓度为0.4 mg/mL时，GSCPs对DPPH的清除率达84%，接近质量浓度为0.2 mg/mL的维生素C的清除率。

羟自由基清除实验中，邻菲罗啉与Fe2+形成络合物，在536 nm处有最大吸收峰。H2O2通过Fenton反应产生羟自由基可将络合物中的Fe2+氧化为Fe3+导致其最大吸收峰消失。如果反应体系中存在羟自由基清除剂，络合物受到的破坏则相对减少。由图1(b)可知，GSCPs具有较强的羟自由基清除能力，且随浓度升高，清除力逐渐升高。当质量浓度为0.4 mg/mL时，GSCPs的羟自由基清除率为89%。

*表示组间差异显著(P<0.05)。图1 GSCPs对DPPH自由基和羟自由基的清除活力Fig.1 DPPH and hydroxyl radical scavenging activity of GSCPs

2.2 GSCPs对DNA氧化损伤的抑制作用

图2为GSCPs对DNA氧化损伤的抑制作用。泳道1、2、3分别为无损伤组、损伤组和样品组。对3组条带进行比较可知：泳道1中超螺旋结构质粒DNA(scDNA)条带清晰，说明无损伤组质粒DNA结构完好；泳道2中超螺旋结构的质粒DNA基本消失，说明损伤组质粒DNA氧化损伤严重；泳道3出现了超螺旋条带，说明GSCPs组与损伤组相比，损伤程度有所降低。研究结果表明GSCPs可抑制DNA氧化损伤。

泳道1为无损伤组；泳道2为损伤组；泳道3为样品组。图2 GSCPs对DNA氧化损伤的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of GSCPs on oxidative damage of DNA

2.3 GSCPs对RAW 264.7巨噬细胞活力的影响

图3为GSCPs对RAW 264.7巨噬细胞活力的影响。由图3可知，与对照组相比，质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的GSCPs对巨噬细胞存活率无明显影响，说明该浓度可以用于后续的ROS实验。

图3 GSCPs对RAW 264.7巨噬细胞活力的作用Fig.3 Effect of GSCPs on cell viability of RAW 264.7 macrophages

2.4 GSCPs对RAW 264.7巨噬细胞内ROS水平的影响

ROS是机体细胞代谢过程中产生的含氧的化学反应性物质，正常生理状态下参与维持机体的生理平衡，过量ROS诱导的氧化应激可导致细胞结构和生物分子功能改变，进而导致细胞损伤。图4是用DCFH- DA探针法检测RAW 264.7巨噬细胞内活性氧水平的荧光显微镜图和光镜图，由图4可知，H2O2处理组的荧光强度最强，H2O2+GSCPs组与前者相比荧光强度降低，说明GSCPs可有效抑制H2O2诱导的RAW 264.7巨噬细胞的氧化损伤。

图片放大倍数均为100倍。图4 DCFH- DA探针法检测RAW 264.7巨噬细胞内 ROS水平Fig.4 Intracellular ROS level in RAW 264.7 macrophages indicated by DCFH- DA probe method

2.5 GSCPs对RAW 264.7巨噬细胞内抗氧化酶活性的影响

图5为GSCPs对RAW 264.7巨噬细胞内SOD和GSH- Px水平的影响。细胞内完善的抗氧化防御体系可清除自由基，如抗氧化酶SOD和GSH- Px即是抗氧化防御体系的重要成员。由图5可知，与对照组相比较，H2O2组细胞内抗氧化酶活性均有所下降，质量浓度为0.2 mg/mL的GSCPs处理组可使胞内SOD活性从H2O2处理组的81.1%升高到96.3%。GSH- Px活性从H2O2处理组的92.1%升高到99.6%。说明GSCPs可正向调节H2O2介导的RAW 264.7巨噬细胞内抗氧化酶活性，逆转H2O2介导的RAW 264.7巨噬细胞的氧化损伤。

图5 GSCPs对RAW 264.7巨噬细胞内SOD和GSH- Px 水平的影响Fig.5 Effect of GSCPs on levels of SOD and GSH- Px in RAW 264.7 macrophages

2.6 GSCPs对秀丽隐杆线虫寿命及存活率的影响

寿命是机体衰老指标之一，而衰老理论之一是过多的自由基在体内积聚，破坏核酸、蛋白质等生物分子的结构和功能，最终导致细胞功能受损促进衰老和死亡。图6是GSCPs对秀丽隐杆线虫存活率的影响，表1是GSCPs对线虫寿命的影响。由图6和表1可知，对照组最长寿命为16.83天，平均寿命为9.54天，质量浓度为0.2 mg/mL的GSCPs组的最长寿命和平均寿命分别为17.17天和9.48天，差异不显著；质量浓度为0.4 mg/mL的GSCPs组的最长寿命和平均寿命分别为19.50天和10.57天，质量浓度为0.8 mg/mL的GSCPs组的最长寿命和平均寿命分别为20.50天和12.18天，差异均具有显著性(P<0.05)，研究结果表明：GSCPs可延长线虫寿命，其中以质量浓度为0.8 mg/mL的GSCPs组效果最佳。

图6 GSCPs对秀丽隐杆线虫存活率的影响Fig.6 Effect of GSCPs on survival rates of Caenorhabditis elegans

表1 GSCPs对秀丽隐杆线虫寿命的影响

2.7 GSCPs对秀丽隐杆线虫急性氧化应激的影响

图7是GSCPs对急性氧化应激条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响，表2是GSCPs对急性氧化应激条件下秀丽隐杆线虫生存时间的影响。由图7和表2可知，急性氧化应激条件下对照组线虫的最长生存时间和平均生存时间分别为4.67 h和3.04 h，质量浓度为0.2 mg/mL GSCPs组的最长生存时间和平均生存时间分别为4.33 h和3.27 h，二者无显著性差异。质量浓度为0.4、0.8 mg/mL GSCPs处理组线虫的最长生存时间分别为5.67 h和6.00 h，平均生存时间分别为3.66 h和4.07 h，差异具有显著性(P<0.05)，研究结果说明GSCPs对急性氧化应激的秀丽隐杆线虫有显著的保护作用，当质量浓度为0.8 mg/mL时保护作用最佳，该结果与秀丽隐杆线虫寿命延长实验结果一致。

图7 GSCPs对急性氧化应激条件下秀丽隐杆线虫 存活率的影响Fig.7 Effects of GSCPs on survival rates of Caenorhabditis elegans under acute oxidative stress

表2 GSCPs对急性氧化应激条件下秀丽隐杆线虫生存时间的影响

2.8 GSCPs对秀丽隐杆线虫体内ROS水平的影响

图8是GSCPs对秀丽隐杆线虫ROS生成量的影响。由图8可知GSCPs处理组与对照组相比ROS水平有所下降，随浓度增加，秀丽隐杆线虫体内ROS水平逐渐降低，质量浓度为0.8 mg/mL GSCPs处理组的ROS清除效果最为显著(P<0.05)，相比对照组降低了56.33%。研究数据表明：GSCPs可有效降低线虫体内的ROS，对抗由于ROS过量引起的氧化应激反应。

*表示组间差异显著(P<0.05)。图8 GSCPs对秀丽隐杆线虫ROS生成量的影响Fig.8 Effects of GSCPs on ROS levels of Caenorhabditis elegans

3 结 论

葡萄籽资源丰富且易获得，但目前对葡萄籽的利用率不高，大多数被填埋或经加工后作为动物饲料。本实验利用水提醇沉法提取GSCPs，从体内外研究其抗氧化活性。结果表明：GSCPs具有对DPPH自由基、羟自由基清除能力及抑制DNA氧化损伤的活性，质量浓度为0.4 mg/mL的GSCPs对DPPH的清除率达84%，对羟自由基清除率为89%；GSCPs可下调氧化损伤的RAW 264.7巨噬细胞ROS水平，提高细胞内SOD和GSH- Px活性，质量浓度为0.2 mg/mL的GSCPs处理组可使细胞内SOD活性从H2O2处理组的81.1%升至96.3%，GSH- Px活性从H2O2处理组的92.1%升至99.6%。体内抗氧化检测表明：GSCPs可延长秀丽隐杆线虫寿命，降低其氧化应激水平，减少秀丽隐杆线虫体内的ROS。质量浓度为0.8 mg/mL 的GSCPs处理组秀丽隐杆线虫的平均寿命较对照组延长27.67%，将急性氧化应激的秀丽隐杆线虫平均存活时间延长33.58%，秀丽隐杆线虫体内ROS生成量较对照组可降低56.33%。体内实验与体外实验结果一致，提示GSCPs具有氧化应激损伤的保护作用。氧化应激反应可引起细胞损伤或凋亡，从而引起肿瘤、心脑血管病变等多种疾病的发生[19]。目前，对氧化应激损伤机制的研究以及由于氧化应激损伤导致的各种疾病的治疗药物的研发均未有突破性进展。未来课题组将继续研究葡萄籽粗多糖的成分、结构及抗氧化作用机理，以期为相关疾病的治疗提供思路，同时为保健品、化妆品等功能产品的开发奠定理论基础。