凯氏定氮全定量、半定量法以及杜马斯燃烧法测定米糠粗蛋白优劣势比较*

李小丹,朱丽琼，曾彩虹，刘 鑫，吴家乾，李丹青，潘传荣

（1.广东湛江国家粮食质量监测站，广东 湛江 524045；2.广东省粮食科学研究所有限公司，广州 510050）

米糠是稻谷加工时糙米碾米的主要副产品，其重量占稻谷总重10%左右，主要成分由种皮和胚构成[1]，米糠营养丰富，是重要的蛋白资源。为提升米糠的利用价值，在米糠中提取蛋白质进行转化利用是多年来的热门课题，如何快速测定米糠或提取物中粗蛋白含量是科研人员经常关注的问题。

粗蛋白含量测量方式有传统的凯氏定氮法和当前越来流行的杜马斯仪器燃烧法，其中凯氏定氮法有全定量和半定量方式。1883年丹麦化学家凯道尔建立了经典的“凯氏定氮法”来测量有机物中的总氮，迄今为止被人们应用了100多年的时间。更早在1831年，法国化学家杜马斯首创一种定氮法，在燃烧管的前端贮有碳酸铅，在试样分解前，燃烧时氮的氧化物通过红热的铜粉后被还原可得出有机物中的含氮量[2]。杜马斯定氮法比凯式定氮法足足早了52年，因为机理复杂和检测成本高导致了在实际应用中受到限制，在热导检测器（TCD）技术成熟应用之后，杜马斯定氮仪才得以普及应用。热导检测器基于不同气体具有不同的热导率，当被测组分与载气一起进入热导池时，由于混合气的热导率的不同，钨丝传向池壁的热量也发生变化，致使钨丝温度发生改变，其电阻也随之改变，进而使电桥输出端产生不平衡电位而作为信号输出。在国家标准GB 5009.5—2016《食品安全标准 食品中蛋白质测定》凯氏定氮法为第一法属仲裁方法，燃烧法为第三法。

本文依据国家标准GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[3]方法以及在实际工作中的检测经验，利用凯氏定氮仪中的全定量和半定量法以及杜马斯燃烧法，分别以全麦粉标准物质与蔗糖配成不同含量粗蛋白标准粉、广东境内丝苗米厂生产的新鲜米糠为检测对象，对3种方法测量粗蛋白的准确性、平行性和线性范围进行测试比较，总结探讨测试人员应用各方法时孰优孰劣。

1 仪器方法

1.1 杜马斯燃烧法

气路和燃烧室温度等仪器状态调试好后，仪器本身有以EDTA为参照物做的内置外标法用的标准曲线，用锡箔纸称粉状样品0.0500 g左右，成团揉好放入自动进样盘，输入蛋白系数，自动测量结果，仪器如图1所示。

图1 德国格哈特N-pro杜马斯定氮仪和自动进样盘

1.2 半定量凯氏定氮法

称取粉状样品1 g于配套石英U型试管中,加入1:12硫酸铜和硫酸钾3.2 g和12 mL硫酸,放入消化炉450℃，全部碳化3 h呈绿色透明,取出冷却，套上定氮蒸馏装置（图2）,放入加好3滴溴甲酚绿亚甲基蓝混合指示剂的2%硼酸150 mL，注入40%NaOH浓碱使消化管硫酸铜沉淀变黑，水蒸气蒸馏使硼酸吸收液到250 mL,转到滴定台手工用0.1 mol/L盐酸标准溶液滴定灰蓝色转棕红色，计算结果。

图2 上海纤检仪器有限公司KDN-2C型半定量凯氏定氮仪和消化炉

1.3 全定量凯氏定氮法

称取粉状样品0.5 g于配套石英U型试管中,加入1:12硫酸铜和硫酸钾2 g和12 mL硫酸,放入石墨消化炉450℃，全部碳化2 h呈绿色透明,取出冷却套上全定量蒸馏装置（图3）,仪器有配好带有混合指示剂的2%硼酸，20%NaOH浓碱和0.05 mol/L盐酸标准溶液储备液，全程自动滴定，以光敏元件判断终定，输入蛋白系数，自动计算结果。

图3 青岛海能KN1100型全定量凯氏定氮仪和消化炉

2 测试对象

2.1 米糠原料

新鲜米糠，梅州建丰粮业发展有限公司提供。

2.2 标准物质

全麦粉粗蛋白质标准物质GBW(E)100126，证书标注粗蛋白含量（15.8±0.3）%、蔗糖和两者混合物，混合物粗蛋白含量见表1。

表1 全麦粉标准物质和蔗糖混合物

3 实验结果

3.1 杜马斯定氮仪

乙二胺四乙酸（EDTA）是一种相对稳定的有机物，其化学式为C10H16N2O8，含N量为9.59%，依次称取不同质量EDTA（纯度大于99.999%）放入燃烧仪测试，记录峰面积，制作标准曲线，蛋白系数米糠取5.95，标准品与混合物取5.7。结果见表2、表3、图4和图5。

表2 EDTA质量和峰面积

图4 杜马斯定氮仪EDTA标准曲线

图5 杜马斯定氮仪测定结果与蛋白理论值测量相关性

3.2 半定量凯氏定氮法

半定量凯氏定氮法结果如表4和图6。

图6 半定量凯氏定氮法测定结果与蛋白理论值测量相关性

表4 样品半定量凯氏定氮法测试结果

3.3 全定量凯氏定氮法

全定量凯氏定氮法结果如表5和图7。

图7 全定量凯氏定氮法测定结果与蛋白理论值测量相关性

表5 样品全定量凯氏定氮法测试结果

4 结果与讨论

（1）分别采用杜马斯燃烧法、半定量凯氏定氮法、全定量凯氏定氮法对全麦粉粗蛋白质标准物质、蔗糖、两者混合物和米糠样品测定，从图5、6、7的测定结果与蛋白理论值测量相关性看出，相关性R2杜马斯燃烧法0.9929＞R2半定量凯氏定氮法0.9885＞R2全定量凯氏定氮法0.9751；从表3、4、5中可以看出杜马斯燃烧法与蛋白理论值的偏差分布在-0.4～0.6之间，半定量凯氏定氮法分布在-1.8～0.1之间，全定量凯氏定氮法分布在-1.6～1.1之间。从数据看出杜马斯燃烧法测量的准确性和稳定性高于凯氏定氮法；凯氏定氮法中的半定量方式优于全定量凯氏定氮法。三种定氮测定方法比较如表6：

表3 样品杜马斯燃烧法测试结果

表6 三种定氮方式比较

（2）通过对凯氏定氮法的全定量和半定量法及杜马斯燃烧法测定蛋白质实验的比较发现，作为蛋白质测定的国家标准方法，三种方法检测结果并没有显着性差异，所以测定米糠中粗蛋白含量时采用三种方法均是可行的。凯氏定氮法所需设备价格低、成本低廉、已经有着广泛的应用，即使在很小的实验室也可以用简单的凯氏定氮装置实现蛋白质的测定，但是操作时间长，有一定的危险性，产生有毒有害气体，危害人体健康，结果易受人为影响。杜马斯燃烧法操作过程简便快捷，时间只需几分钟，不需人看管，不产生有毒有害物质，但是仪器很昂贵，检测成本高。然而，在今天人们越来越注重人员健康和环境保护，鉴于杜马斯燃烧法显而易见的优点，在蛋白质检测领域有逐渐增多趋势。