高效液相色谱法同时测定和营合剂中阿魏酸和丹酚酸B含量*

2022-10-11唐静月张文明费倩倩卞振华袁晓航胡敏敏

中国药业 2022年19期

唐静月，张文明，费倩倩，卞振华，袁晓航，胡敏敏

（江苏省无锡市中医医院，江苏无锡 214000）

和营合剂为无锡市中医医院研制的中药复方制剂，由当归、丹参、白芍、女贞子、生地、桑叶、茯苓、合欢皮、柴胡9味中药材组方。方中，当归、丹参通行血脉，活血化瘀；女贞子、白芍、桑叶、生地补益肝肾之阴，平抑肝阳；茯苓、合欢皮健脾宁心，安神解郁；柴胡升清达阳，并可引诸药直达病所。诸药合用，具有活血化瘀、和营退斑功效［1］，临床主要用于治疗面部色斑、夜寐不安等证。现行质量标准收载于《江苏省食品药品监督管理局医疗机构制剂标准》JSZBZ20090058Z，仅有性状和制剂通则检查项目，未收载含量测定，且有关该制剂的质量控制标准及主要成分的基础研究少有报道。为进一步控制和营合剂的质量，保证临床用药的有效性和安全性，本研究中建立了同时测定和营合剂中阿魏酸和丹酚酸B含量的高效液相色谱（HPLC）法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；BSA224S-CW型电子天平（德国Sartorius公司，精度为万分之一）；KQ-300E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为300 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

阿魏酸对照品（批号为B20007），丹酚酸B对照品（批号为B20261），均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均不低于98%；和营合剂（医院制剂，批号分别为20211025，20211026，20211027）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min时5%A～10%A，5～15 min时10%A～14%A，15～25 min时14%A～15%A，25～30 min时15%A～17%A，30～45 min时17%A～21%A，45～55 min时21%A～22%A，55～63 min时22%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：321 nm；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

取阿魏酸、丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含阿魏酸22.74 μg、丹酚酸B 270.48 μg的混合对照品溶液。精密量取样品3 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理（功率为300 W，频率为40 kHz）10 min，放冷，用甲醇定容，摇匀，滤过，即得供试品溶液。取不含当归和地黄、不含丹参的阴性样品，按供试品溶液制备方法分别制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：精密吸取2.2项下4种溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。供试品溶液色谱中，阿魏酸和丹酚酸B色谱峰有效分离，峰形良好，对照品溶液色谱存在相应色谱峰，且阴性对照品溶液对测定无干扰。

图1 高效液相色谱图1.Ferulic acid 2.Salvianolic acid BA.Mixed reference solution B.Test solution C，D.Negative reference solution（lacking Angelicae Sinensis Radix and Rehmanniae Radix，lacking Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取2.2项下混合对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，5.0 mL，分别置5 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，按2.1项下色谱条件进样测定，分别以阿魏酸和丹酚酸B溶液的质量浓度为横坐标（X，μg/mL）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得阿魏酸和丹酚酸B的回归方程分别为Y阿=36.552X阿+2.620（r=0.9999，n=6），Y丹=5.935X丹-119.655（r=0.9997，n=6）。结果表明，阿魏酸和丹酚酸B质量浓度分别在2.27～22.74 μg/mL和27.05～270.48 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果阿魏酸和丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.18%和0.98%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20211025）样品，依法制备供试品溶液，分别于0，2，8，12，16，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定。结果阿魏酸和丹酚酸B峰面积的RSD分别为1.76%和1.95%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（批号为20211025）样品6份，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。结果阿魏酸和丹酚酸B平均含量分别为7.87 μg/mL和193.38 μg/mL，RSD分别为2.27%和0.80%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的样品（批号为20211025）1.5 mL，共6份，分别置5 mL容量瓶中，加入阿魏酸和丹酚酸B对照品溶液适量，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，计算阿魏酸和丹酚酸B的加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 样品含量测定

取3批（批号分别为20211025，20211026，20211027）样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。结果每1 mL样品中分别含阿魏酸7.84，7.72，7.75 μg，平均7.77 μg；丹酚酸B 196.41，192.95，190.16 μg，平均193.17 μg。

3 讨论

3.1 指标成分选择

方中当归具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效［2］139，有抗炎、免疫调节、抗抑郁、抗氧化、促进造血功能、调血脂、保肝强肾健体等药理作用［3-5］，其主要化学成分有挥发油、有机酸、多糖类、黄酮类、氨基酸等［6］，阿魏酸是当归酚酸类代表性成分和指标性成分；丹参具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效［2］79，有改善微循环、抗心肌缺血、防治动脉粥样硬化、抗炎、抗氧化、调血脂等多种药理作用［7-9］，其主要化学成分有菲醌衍生物、酚酸类、黄酮类、挥发油、无机元素等［10-11］，其中菲醌衍生物与酚酸类化合物是丹参的主要活性成分，以脂溶性成分丹参酮类和水溶性成分丹酚酸类为代表。根据和营合剂中主要药味的活性成分及药理作用，并结合制剂工艺特点及实际情况，选择阿魏酸和丹酚酸B作为其质量控制的指标成分。经前期预试验，进行单味药制备与进样，发现全方9味药材中当归和地黄均含有阿魏酸，且地黄中阿魏酸含量不低，单独制备的缺当归阴性对照品溶液色谱图明显可见阿魏酸色谱峰，为避免阴性出现干扰，故本研究中制备缺当归和地黄的阴性对照品溶液。

3.2 色谱条件选择

考察等度洗脱和梯度洗脱2种模式发现，前者不能较好地分离极性差异大的物质，而后者可使复杂样品中性质差异较大的组分达到良好分离。分别考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液为流动相时色谱峰的分离效果，结果乙腈洗脱效果优于甲醇；其中，加0.2%磷酸水溶液和0.2%甲酸水溶液均优于纯水体系，乙腈-0.2%磷酸水溶液体系获取的色谱峰更全面，基线平稳，阿魏酸和丹酚酸B与相邻色谱峰分离效果较好，色谱峰峰形良好。故选择乙腈-0.2%磷酸水溶液（梯度洗脱）作为流动相系统。

采用二极管阵列检测器做全波长扫描，阿魏酸和丹酚酸B最大吸收波长分别为321 nm和286 nm。2020年版《中国药典（一部）》当归药材含量测定项下，阿魏酸的检测波长为316 nm。为了保证2种成分均有适宜的灵敏度和峰面积响应值，同时记录286，316，321，322，323 nm波长下的色谱峰。结果检测波长为321 nm时，阿魏酸和丹酚酸B峰面积响应值较大，灵敏度较高，与相邻色谱峰分离效果较好。故选择321 nm作为检测波长。

考察不同柱温（25，30，35℃）和不同流速（0.8，1.0 mL/min），以色谱峰峰形、分离度、色谱峰数目、信号响应强弱为指标。结果柱温为30℃时，色谱峰峰形好、数目多，分离度良好，2种成分响应值较大；流速为1.0 mL/min时2种成分与相邻色谱峰分离效果好。综合考虑，选择柱温为30℃，流速为1.0 mL/min。

3.3 提取方法和溶剂选择

曾考察超声提取（功率为300 W，频率为40 kHz）10，20，30 min的影响，结果超声提取10 min时2种待测成分提取率较高。曾考察不同提取溶剂50%甲醇、70%甲醇、甲醇和70%乙醇，结果显示，70%乙醇提取下的色谱峰较少、峰面积较小；不同体积分数甲醇提取的色谱峰信息均较全面，2种有效成分在以甲醇为提取溶剂时的提取率最高。故选择甲醇作为提取溶剂。