罂粟壳炮制前后无机元素含量差异及地域分布特点*

徐继军，张明童，李冬华，宋平顺，马 潇

（甘肃省药品检验研究院·甘肃省中藏药检验检测技术工程实验室·国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室，甘肃 兰州 730070）

罂粟壳为罂粟科植物罂粟Papaver somniferumL.的干燥成熟果壳［1］，可镇痛、镇咳和止泻［2-3］。罂粟壳含有生物碱类、糖类及其衍生物等化学成分［4］，其中生物碱吗啡久服易成瘾，是唯一按麻醉药品管理的中药饮片［5］，故临床为减轻其毒副作用多采用炮制品或配伍使用。目前，对中药药效物质基础的研究多以有机物质为主，忽视了无机物质在其中发挥的作用。现代研究认为，中药功效的发挥是有机成分和无机成分的协同作用［6］，且微量元素在中药活性的表达中起着重要作用［7-8］。中药的无机元素变化对中药药效的物质基础具有重要意义［9-11］。罂粟壳引起中毒反应的物质基础主要为吗啡等阿片类生物碱，炮制后毒性可降低，止咳和止痢作用可增强，其化学成分也发生了变化［12］。因此，考察罂粟壳炮制前后无机元素的含量，可为阐明其药效发挥的物质基础提供参考。本研究中采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法测定了罂粟壳炮制前后无机元素的含量，并通过正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）法找出含量差异显著的无机元素，比较炮制前后的变化，为罂粟壳和蜜罂粟壳的鉴别、产地区分、质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津2030型电感耦合等离子体质谱仪（日本岛津公司）；Multiwate 7000型超级微波消解仪（奥地利安东帕公司）；ME204型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度为万分之一）。

1.2 试药

混合元素标准溶液［含银（Ag）等36种元素，质量浓度为10 μg/mL，批号为R2-MEB 694161］，汞（Hg）元素标准溶液（质量浓度为1000 μg/mL，批号为R2-MEB814561），均购自美国IV公司；金（Au）元素标准溶液（中国计量科学研究院，质量浓度为1000 μg/mL，批号为20191206）；内标溶液［美国安捷伦公司，含钛（48Ti）、铑（103Rh）、铼（186Re），质量浓度为1000 μg/mL，批号为CL3-188MK BY1］；65%硝酸（优级纯，苏州晶瑞化学股份有限公司）；超纯水（实验室自制）；罂粟壳（编号为S22-S31）及蜜罂粟壳（编号为S32-S41）各10批，均由甘肃普安制药股份有限公司提供，产地分别为张掖（编号为S22-S26，S32-S36）和金昌（编号为S27-S31，S37-S41），经甘肃省药品检验研究院马潇主任药师鉴定均为正品。炮制蜜罂粟壳时，每100 kg罂粟壳用炼蜜20 kg。

2 方法与结果

2.1 ICP-MS条件

射频功率：1200 W；雾化气压力：100 psi；雾化温度：2℃；等离子体气体流速：18.0 L/min；氦气（He）碰撞压力：0.1 MPa；脉冲电压：800 V；辅助气体流速：0.8 L/min；载气流速：0.86 L/min；冷却循环水温度：20℃。测定模式为He模式，重复测量3次。

2.2 微波消解条件

采用超级微波消解仪对样品进行前处理。设置参数：功率，梯度变化（0～5 min时0～800 W，5～15 min时800 W，15～30 min时800～1200 W，30～50 min时1200 W）；冷却温度为80℃。温度、压力、时间、微波功率等参数可通过编程实现自动控制，从而降低系统误差，提高样品处理的重复性和方法研究的稳定性，并采用变频微波加热系统，使消解温度更均匀，消解速率更快，样品消解更彻底、完全。

2.3 溶液制备

标准溶液：分别精密吸取36种混合元素标准溶液（质量浓度为10 μg/mL）和Hg元素标准溶液（质量浓度为1000 μg/mL）适量，加3%硝酸溶液制成质量浓度分别为0.01，0.10，0.50，1.00，10.00，100.00，500.00 ng/mL的36种系列混合标准溶液和质量浓度分别为0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00 ng/mL的系列Hg元素标准溶液。精密吸取Au元素标准溶液（质量浓度为1000 μg/mL）适量，加3%硝酸溶液稀释成质量浓度为1 μg/mL的标准溶液。

内标溶液：分别精密吸取质量浓度为1000 μg/mL的103Rh和186Re内标溶液适量，加3%硝酸溶液制成质量浓度为50 ng/mL的混合内标使用液。分析过程中，为校正补偿样品的基体效应和信号漂移，选择48Ti，103Rh，186Re作为内标，通过蠕动泵在线加入，内标和样品的稀释因子约为1/10。

供试品溶液：取20批（编号为S22-S41）样品，粉碎，过3号筛，取0.3 g，精密称定，置石英消解罐中，加入2 mL硝酸和1 mL超纯水，混匀，按2.2项下程序消解。待消解完全后，取出，放冷，转移至25 mL容量瓶中，用少量水洗涤消解罐，合并洗液于容量瓶中，加入Au元素标准溶液（质量浓度为1 μg/mL）200 μL，用3%硝酸溶液定容，摇匀，即得。

空白样品溶液：除不加入Au元素标准溶液外，按供试品溶液制备方法制备。

2.4 方法学考察

线性关系考察、检测限和定量限确定：吸取2.3项下系列混合标准溶液和Hg元素标准溶液各适量，按2.1项下ICP-MS条件进样测定，以各标准品质量浓度（X，ng/mL）为横坐标、响应值（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1，表明各元素在各自质量浓度范围内与响应值线性关系良好。按试验方法测定空白样品溶液，平行11次，计算空白标准偏差SD，分别以3倍和10倍SD/k（k为标准曲线的斜率）计算得仪器检测限（3 σ）和定量限（10 σ）。按如下公式计算：检测（定量）限浓度（μg/kg）=3 σ（10 σ）×稀释倍数×10-3/理论取样量。结果见表1。

表1 线性关系考察、检测限和定量限确定结果Tab.1 Results of the linear relation test，limit of detection and limit of quantitation

精密度试验：取供试品溶液适量，按2.1项下ICP-MS条件连续进样测定6次。结果各元素质量浓度的RSD为0.88%～1.34%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取2.3项下供试品溶液6份，按2.1项下ICP-MS条件进样测定。结果各元素质量浓度的RSD为0.96%～3.88%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（编号为S22），按2.3项下方法制备供试品溶液，分别于配制后0，2，4，8，10 h时按2.1项下ICP-MS条件进样测定。结果各元素质量浓度的RSD为0.44%～2.87%（n=5），表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（编号为S22）适量，精密称定，共9份，分别加入高、中、低质量浓度的37种混合元素标准溶液，各3份，按2.1项下ICP-MS条件进样测定，按外标法计算各元素含量。结果各元素的平均加样回收率为85.61%～102.10%，RSD为0.83%～4.87%（n=9），表明方法准确度良好。

2.5 罂粟壳炮制前后无机元素含量变化

取样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下ICP-MS条件进样测定，无机元素含量变化见图1。可见，Sr，Rb，Mn，Ba，Cr，Cu，Ni元素在样品中含量丰富。《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》规定，重金属及有害元素的限量为Hg≤0.2 mg/kg，As≤2.0 mg/kg，Pb≤5.0 mg/kg，Cu≤20.0 mg/kg，Cd≤0.3 mg/kg。除Pb外，罂粟壳和蜜罂粟壳中重金属及有害元素Cd，As，Hg，Cu的含量均低于规定限度，且炮制后重金属及有害元素含量均有所减少。

图1 罂粟壳与蜜罂粟壳中无机元素含量变化Note：Comparison of inorganic element contents between Papaveris Pericarpium and honey-stir-baked Papaveris Pericarpium，*P<0.05.Fig.1 Change of inorganic element contents in Papaveris Pericarpium and honey-stir-baked Papaveris Pericarpium

采用SPSS 26.0统计学软件对罂粟壳和蜜罂粟壳中37种无机元素的含量分别进行差异分析。结果显示，罂粟壳和蜜罂粟壳中Ag，As，Cd，Hg，Th，V，Y，Co，Li，Cu，Sr元素的含量有显著差异（P<0.05），蜜罂粟壳中Th，V，Y，Co，Li，Sr元素的含量较罂粟壳显著增加，而Ag，As，Cd，Hg，Cu元素的含量较罂粟壳显著降低。Be，Dy，Er，Eu，Gd，Ho，Lu，In，Pr，Tb，Tl，Tm，Yb元素的含量均低于检测限，故未纳入图中。详见图1。

2.6 产地分布特点分析

将测得的各无机元素含量导入SIMCA 14.0软件，用OPLS-DA法分析样品的聚集情况，罂粟壳和蜜罂粟壳的OPLS-DA模型得分图见图2。可见，罂粟壳和蜜罂粟壳均表现出明显的聚类，且组间分离更明显，表明罂粟壳和蜜罂粟壳无机元素含量差异显著；不同产地罂粟壳样品聚集明显且样品点没有重叠，表明OPLS-DA法可较好地区分产地。但蜜罂粟壳样品受蜜炙影响不能明显区分产地，故有重叠部分。该模型解释率（R2）为0.936，预测力参数（Q2）为0.928，均大于0.5，且接近于1.0，表明所建立模型的解释率和预测能力均较好。

图2 OPLS-DA模型得分图1.Papaveris Pericarpium 2.Honey-stir-baked Papaveris PericarpiumFig.2 Scoring diagram of OPLS-DA model

采用置换检验验证OPLS-DA模型的拟合程度，结果见图3。可见，R2拟合直线在Y轴的截距为0.1，Q2拟合直线在Y轴的截距小于0，表明所建立的模型可靠，不存在过度拟合，具有较好的预测能力。

图3 OPLS-DA模型荷载图Fig.3 Loading diagram of OPLS-DA model

由上述模型分析得到无机元素的变量权重（VIP），当VIP≥1时该变量对组间差异的影响大，可作为组间特征性成分，故以VIP>1为指标进行筛选，得到重要性变量VIP贡献率，详见图4。可见，差异性无机元素影响程度从大到小依次为As>Nd>Ce>La>Mn>Cd>Y>Sr>Co>Hg>Cu>Th>Li>Ag>Rb。

图4 无机元素变量的VIP图Fig.4 VIP diagram of inorganic element variables

3 讨论

本研究中采用超级微波消解仪对样品进行前处理，其具有自动化操作智能微波化学工作平台，可多通道、快速、完全消解样品，且消解试剂用量少，减少了样品的空白值和背景干扰，同时有利于节能减排；变频微波加热系统使加热更均匀，样品消解更彻底，有利于提高样品处理的重复性和方法研究的稳定性。相较于电热板消解和普通微波消解等常规方法，超级微波消解试剂使用量更少，用时短，无需赶酸，稀释后可直接上机分析，操作方便快捷。从试验结果来看，取3个平行样品进行消解，测得各无机元素含量间的RSD均小于3%，表明具有较好的重复性和稳定性。另外，通过ICP-MS法测定，采用He碰撞模式和在线加入内标溶液，能有效降低背景噪音值，排除基体效应对多元素产生的干扰。由于采样锥对Hg元素具有较强的吸附性，在样品定容前加入一定量的Au元素，使形成金汞齐（Au2Hg），减少采样锥对Hg元素的吸附，从而确保样品中Hg元素测定结果的准确性。

由图1可知，罂粟壳炮制前后的Sr，Rb，Mn，Ba，Cr，Cu，Ni等无机元素含量较高，罂粟壳和蜜罂粟壳中Ag，As，Cd，Hg，Th，V，Y，Co，Li，Cu，Sr元素含量有显著差异（P<0.05），其中炮制后的Th，V，Y，Co，Li，Sr元素含量较炮制前均显著增加，而Ag，As，Cd，Hg，Cu元素的含量较炮制前均显著降低。重金属及有害元素As，Cd，Hg，Cu炮制后含量显著下降，可能是罂粟壳炮制后减毒的原因之一。另外，炮制蜜罂粟壳时，每100 kg罂粟壳用炼蜜20 kg，罂粟壳炮制前后上述元素的变化也可能与加入炼蜜有关，但有待进一步研究。

采用OPLS-DA法对无机元素进行聚类，能有效区分罂粟壳和蜜罂粟壳，其中As，Nd，Ce，La，Mn，Cd，Y，Sr，Co，Hg，Cu，Th，Li，Ag，Rb的VIP均大于1，均为其差异性无机元素。

综上所述，本研究中建立的超级微波消解-ICP-MS法操作便捷、准确度和灵敏度均较高，为罂粟壳和蜜罂粟壳的鉴别和产地区分提供了新思路。从无机元素变化角度，为探究罂粟壳炮制减毒、增强补益功效的科学内涵提供了基础资料，可为罂粟壳药材的质量控制及安全性评价提供科学依据。