LncRNA NR2F2-AS1靶向抑制miR-129-5p调控子宫内膜癌细胞增殖和凋亡研究〔1〕

华金仁，程慧明，严菁，曾丹，潘玫

(江西省妇幼保健院，江西 南昌 330006)

子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤之一。目前的治疗手段主要有手术、化疗、放疗及靶向治疗等。约有70%的子宫内膜癌诊断时，肿瘤局限于子宫体，属于临床早期，预后较好。然而晚期子宫内膜癌患者复发率高(66.7%)、预后差、生存期短，5年生存率仅为16.0%。现阶段，围绕子宫内膜癌发病分子机制展开深层次研究，从中找出个性化精准治疗靶点，已成为子宫内膜癌基础性、全面性研究的重心所在[1]。报道[2]指出，长链非编码RNA(LncRNA)可能参与信号通路调控机制，与microRNA(miRNA)相互作用，从而对子宫内膜癌的生长与发展造成影响。另有研究[3]强调，核受体亚家族2组F成员2反义RNA1(NR2F2-AS1)在非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌及前列腺癌组织中表达上调，且与癌细胞的凋亡和增殖相关，但其在子宫内膜癌中的作用尚未明了。本文经Lnc Base预测得知，微小RNA-129-5(miR-129-5p)可能是NR2F2-AS1的靶基因。在子宫内膜癌细胞中，miR-129-5p的表达下调。针对过表达miR-129-5p来分析，其不仅能够有效抑制子宫内膜癌细胞的增殖，而且能抑制其迁移与侵袭，另外还可以对细胞凋亡实施相应诱导。本研究围绕子宫内膜癌细胞(Ishikawa)，就miR-129-5p和LncRNA NR2F2-AS1对子宫内膜癌细胞增殖及凋亡的影响进行探讨。报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2020年4月—2020年12月收治的经病理学检查确诊的子宫内膜癌患者50 例，术前均没有进行放疗和化疗，年龄(43.25±5.49) 岁，子宫内膜癌分期：Ⅳ期12 例、Ⅲ期15 例、Ⅱ期10 例、Ⅰ期13 例。

美国Gibco公司生产的高糖杜尔贝科改良鹰培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS)；美国ATCC公司生产的人子宫内膜癌细胞株(Ishikawa)；美国Sigma-Aldrich公司生产的二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶；赛默飞世尔科技公司生产的反转录试剂盒(RT-PCR)；宝生物工程(大连)有限公司生产的实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)试剂盒、Lipofectamine 2000转染试剂盒、Trizol试剂；美国BD公司生产的流式细胞仪和流式试剂；上海吉玛制药技术有限公司生产的双荧光素酶报告载体(NR2F2-AS1野生型和突变型)、真核表达载体(pcDNA，阴性对照)、miRNA阴性对照(miR-NC)、miR-129-5p抑制剂、miR-129-5p模拟物(miR-129-5p)、NR2F2-AS1过表达载体(pc DNA-NR2F2-AS1)、NR2F2-AS1干扰剂(si-NR2F2-AS1)；美国Santa Cruze公司生产的甘油醛-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)抗体、转染p21基因(p21)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)；美国Promega公司生产的兔抗人单克隆(Bax)抗体和双荧光素酶报告系统；美国Bio-Rad公司生产的全自动酶标仪和Real-time PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

采用高糖DMEM培养液(内含1%青-链霉素、10% FBS)进行培养，然后把培养瓶置入到二氧化碳(CO2)(5%)培养箱(温度设为37 ℃)中，湿度控制在95%。当细胞生长至对数期时，进行洗涤消化，并按照1∶3传代。

1.2.2 细胞转染

收集子宫内膜癌组织样本转染后的Ishikawa细胞，依据特定比例，接种在6孔板中(每孔2×105个)。需要指出的是，在细胞培养过程中，当融合成一层时，便可进行转染操作。采用当前比较常用的Lipofectamine 2000，把pc DNA-NR2F2-AS1，miR-129-5p和真核表达质粒(pc DNA)等转染到Ishikawa细胞中，培养时间控制在4 h，然后向完全培养基进行转染，转染48 h后，收集细胞。

1.2.3 Real-time PCR检测RNA表达

收集子宫内膜癌组织样本转染后的Ishikawa细胞，对组织样本和细胞总RNA进行提取，反转录合成cDNA，然后将cDNA当作模板，实施Real-time PCR反应，合成miR-129-5p和LncRNA NR2F2-AS1。反应程序：72 ℃ 40 s，59 ℃ 40 s，94 ℃40 s，95 ℃ 5 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

1.2.4 经四唑盐比色法准确测定细胞活性

收集已经完成转染的Ishikawa细胞，同样依据特定比例(每孔2×103个)，围绕96微孔板，实施逐一接种操作，完成后，均置入事先准备好的培养箱中，继续培养。在培养过程中，分别在24 h，48 h，72 h进行MTT实验。各孔均置入20 μL MTT(5 mg/mL)，培养4h，弃上清，加入DMSO，每孔150μL，振荡10 min，用酶标仪对吸光度(OD)(490 nm)进行测定。

1.2.5 测定细胞凋亡率

Ishikawa细胞均培养至对数期，实施转染，然后接种于6孔板，培养48 h；收集细胞进行洗涤，次数不易过多，两次为宜。根据凋亡试剂盒说明书展开各项操作，用流式细胞仪获取凋亡率。

1.2.6 用双荧光素酶报告系统进行相关实验

参照上述手段，以Ishikawa细胞为研究对象，进行培养、转染等操作。选取两种双荧光素酶报告载体[一种为野生型LncRNA NR2F2-AS1(WT-NR2F2-AS1)，另一种为突变型LncRNA NR2F2-AS1(MUT-NR2F2-AS1)]，联合miR-129-5p，以Ishikawa细胞为对象，进行共转染处理，48 h后对细胞实施各项操作(如收集、裂解等)。最后进行离心操作，收集上清液，检测其荧光素酶活性。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 子宫内膜癌组织中miR-129-5p和LncRNA NR2F2-AS1的表达

子宫内膜癌组织中LncRNA NR2F2-AS1含量明显高于正常子宫内膜组织(P<0.05)，miR-129-5p含量显著低于正常子宫内膜组织，差异均有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 子宫内膜癌组织当中miR-129-5p和LncRNA NR2F2-AS1的表达

2.2 干扰LncRNA NR2F2-AS1表达对Ishikawa增殖的抑制情况si-NR2F2-AS1组LncNR2F2-AS1表达量

低于si-NC组(P<0.05)(si-NR2F2-AS1表示加入NR2F2-AS1干扰剂；si-NC表示阴性对照)，OD490在各时间段(24 h，48 h，72 h)及CyclinD1表达量都低于si-NC组(P<0.05)，p21表达量显著高于si-NC组(P<0.05)(见图1与表2)，提示干扰LncNR2F2-AS1表达能够抑制Ishika增殖。

图1 增殖相关蛋白表达

2.3 干扰LncRNA NR2F2-AS1表达对Ishikawa凋亡的影响

si-NR2F2-AS1组Ishikawa凋亡率和Bax含量高于si-NC组(P<0.05)，Bcl-2含量低于si-NC组(P<0.05)(见图2和表3)，表明干扰LncRNA NR2F2-AS1表达可诱导Ishikawa凋亡。

表2 干扰LncRNA NR2F2-AS1表达对Ishikawa增殖的影响

(a)为凋亡相关蛋白表达；(b)为细胞凋亡流式图

表3 干扰LncRNA NR2F2-AS1表达 对Ishikawa凋亡的影响

2.4 miR-129-5p过表达可抑制Ishikawa增殖和诱导其凋亡

miR-129-5p组在48 h和72 h时OD490明显低于miR-NC组(P<0.05)(miR-129-5p表示miR-129-5p模拟物，miR-NC表示阴性对照)，细胞凋亡率高于miR-NC组(P<0.05)，CyclinD1和Bcl-2含量低于miR-NC组(P<0.05)，p21和Bax含量高于miR-NC组(P<0.05)(见图3和表4)，提示过表达miR-129-5p能够抑制Ishikawa细胞增殖，加速细胞凋亡。

(a)为增殖和凋亡相关蛋白表达，(b)为细胞凋亡流式图

表4 过表达miR-129-5p对Ishikawa细胞增殖与凋亡的影响

2.5 LncRNA NR2F2-AS1靶向调控miR-129-5p表达

LncBase预测结果显示，LncRNA NR2F2-AS1序列中含有与miR-129-5p互补的序列(见图4)。双荧光素酶报告实验结果显示，过表达miR-129-5p组野生型WT-NR2F2-AS1的萤火虫荧光素酶相对活性显著下降(P<0.05)，而突变型MUT-NR2F2-AS1的萤火虫荧光素酶相对活性无明显变化(见表5)。提示LncRNA NR2F2-AS1在细胞中与miR-129-5p之间可能存在相关性。

(a)为增殖和凋亡相关蛋白表达，(b)为细胞凋亡流式图

表5 双荧光素酶报告实验结果

2.6 LncRNA NR2F2-AS1与miR-129-5p的调控关系

qRT-PCR结果发现，pcDNA的miR-129-5p为(1.00±0.08)，pcDNA-NR2F2-AS1的miR-129-5p为(0.51±0.04)，si-NC的miR-129-5p为(0.99±0.07)，si-NR2F2-AS1的miR-129-5p为(2.47±0.23)。pcDNA-NR2F2-AS1的miR-129-5p水平低于pcDNA(t=3.741，P<0.05)，si-NR2F2-AS1的miR-129-5p水平高于si-NC(t=4.162，P<0.05)，提示过表达NR2F2-AS1可显著下调miR-129-5p含量；干扰NR2F2-AS1表达显著上调miR-129-5p表达量。

3 讨 论

LncRNA不仅在子宫内膜癌发病机制中发挥重要作用，而且在子宫内膜癌细胞的代谢、侵袭及转移过程中扮演非常重要的角色[4]。对于LncRNA NR2F2-AS1来说，当前已证实，其在许多类型的肿瘤组织中均存在不同程度的表达异常[5]。针对此情况，适当下调其表达，可以达到有效抑制癌细胞增殖的目的，另外还可促进细胞的快速凋亡[6-7]。既往研究[6]还发现，miR-129-5p在乳腺癌、胃癌、前列腺癌中均存在明显的低表达；miR-129-5p过表达不仅可以抑制肿瘤增殖，加速细胞凋亡，而且对肿瘤的迁移、侵袭同样有着良好的抑制作用。本研究发现，与正常子宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织中的LncRNA NR2F2-AS1呈现高表达，miR-129-5p呈现低表达，表明LncRNA NR2F2-AS1与miR-129-5p在子宫内膜癌中发挥着重要作用。干扰LncRNA NR2F2-AS1表达后，LncRNA NR2F2-AS1在Ishikawa细胞中的含量明显下降，各时间段OD490及Cyclin D1的表达量都有降低，p21表达则与之相反，呈现明显升高趋势，提示干扰NR2F2-AS1表达可抑制Ishikawa细胞的增殖。还需指出的是，在过表达miR-129-5p后，Ishikawa细胞中的miR-129-5p含量有明显增加；48 h和72 h OD490明显下降，miR-129-5p细胞凋亡率高于miR-NC，CyclinD1和Bcl-2含量降低，p21和Bax含量升高，提示过表达miR-129-5p能够抑制Ishikawa细胞增殖，加速细胞凋亡。从LncBase预测得知，在LncRNA NR2F2-AS1序列中，含有互补于miR-129-5p的核苷酸序列，提示miR-129-5p与NR2F2-AS1之间可能存在调控关系，或者是结合位点，这为LncRNA NR2F2-AS1靶向调控miR-129-5p的表达提供理论基础。提示LncRNA NR2F2-AS1与miR-129-5p之间可能存在相关性。从qRT-PCR结果得知，pcDNA-NR2F2-AS1的miR-129-5p水平低于pcDNA，si-NR2F2-AS1的miR-129-5p水平高于si-NC，提示过表达NR2F2-AS1可显著下调miR-129-5p含量；干扰NR2F2-AS1表达显著上调miR-129-5p表达量，表明miR-129-5p与NR2F2-AS1之间可能存在调控关系，这为LncRNA NR2F2-AS1靶向调控miR-129-5p的表达提供理论基础。

综上所述，干扰LncRNA NR2F2-AS1可以靶向促进miR-129-5p的表达，从而抑制子宫内膜癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，可望为子宫内膜癌的治疗提供新的靶点。但是本研究样本量较少，在之后的研究中，我们会扩充样本量，进行进一步研究。