蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肝、肾损伤的改善作用

党 娅 ，尤 丽 ，杨彬彦

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723000；2.陕西省果业管理局秦巴山区蓝莓研究所，陕西汉中 723000；3.陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中 723000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种代谢性疾病，是由于胰岛素产生不足导致空腹血糖水平升高，已在全球范围内流行。全球4.1 亿糖尿病患者及3.18 亿存在患糖尿病风险的人群中，中国占三分之一以上，其中2 型糖尿病的发病率约为90%。2 型糖尿病患者发病机理复杂，主要特征是血糖水平升高，机体长期处于高血糖状态不仅会导致糖脂代谢的异常、炎症反应、氧化应激等病理变化，还会导致眼、肾、肝脏等组织器官并发症的产生，无法行使正常的代谢功能，严重时可导致器官衰竭甚至死亡。糖尿病肾病是糖尿病最主要的并发症，约占糖尿病患者的40%，具有动脉粥样硬化的风险。糖尿病肝病是继发于糖尿病导致的肝脏结构与功能损伤的一种慢性并发症，肝脏的损伤又使机体糖脂代谢紊乱，糖尿病病情进一步加重。因此，保护肝肾的正常功能，对控制糖尿病的发生与发展具有重要意义。

治疗糖尿病的两种传统方法是注射胰岛素和口服降糖药。这些药物虽能改善2 型糖尿病患者的健康状况，但会产生低血糖、心脑血管疾病、胃肠道疾病等副作用，对糖尿病并发症的治疗效果甚微。近年来，许多国内外研究学者发现，许多日常消费的食品，如各种水果蔬菜中的天然活性物质，都表现出良好的缓解糖尿病并发症的作用。因此，利用饮食治疗2 型糖尿病已经成为一种新策略。研究发现，植物中的花青素具有良好的降糖作用，与机体抗氧化活性的加强、脂质过氧化损伤的降低密切相关，如黑米花青素、葡萄籽花青素等。因此，在抑制氧化应激诱导的损伤方面具有优异抗氧化活性的天然活性物质成为降低糖尿病风险的最佳治疗策略。

蓝莓含有丰富的营养成分，如蛋白质、脂肪、碳水化合物、花青素、尼克酸等，其中花青素含量高达387～487 mg/100 g，具有较高的营养价值。蓝莓花青素是从蓝莓中提取的一种类黄酮天然色素，是迄今为止最高效的抗氧化剂之一，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抑制肿瘤细胞生长、调节肠道菌群等功能作用。Si 等的研究发现，含有花青素的饮食可有效控制食物摄入量和肝脏重量，并显著降低肥胖触发的胰岛素抵抗，还能有效地改善脂肪变性和细胞肿大。但目前在蓝莓花青素修复肝脏、肾脏损伤方面的研究较少，仍需深入研究。因此，本试验采用链脲佐菌素联合高脂、高糖饲料诱导2 型糖尿病小鼠模型，探讨蓝莓花青素对糖尿病小鼠脏器组织损伤的修复作用，为蓝莓花青素在功能食品的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF 级雄性昆明小鼠 65 只，体重20～25 g，动物许可证号SCXK（陕）2020-001，西安恩斯维尔生物科技有限公司。普通饲料、高脂饲料 成都达硕试验动物有限公司（许可证号SCXK（川）2019-031）。普通饲料配方：玉米73.5%，麦麸20%，鱼粉5%，谷粉1%，食盐0.5%；高脂饲料配方：普通饲料66.5%，蔗糖20%，胆固醇2.5%，胆酸盐1%，猪油10%。所有试验动物均饲养于24±2 ℃的恒温恒湿动物房内，自由饮食、饮水。

蓝莓花青素（纯度40.1%） 杨凌萃健生物工程技术有限公司（CP190914）；盐酸二甲双胍片 上海普康药业股份有限公司；链脲佐菌素 美国Sigma公司；柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖 分析纯，天津市盛奥化学试剂股份有限公司；生理盐水、4%多聚甲醛组织固定液 广州赛国生物科技有限公司；PBS 磷酸盐缓冲液 上海源叶生物科技有限公司；苏木素、伊红 武汉赛维尔生物科技有限公司；中性树胶北京索莱宝科技有限公司；高效切片石蜡 上海佩欧生物科技有限公司；谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）检测试剂盒 江苏晶美生物科技有限公司；血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）检测试剂盒 上海生工生物工程股份有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所。

高速冷冻离心机、微型离心机 湖南湘仪离心机有限公司；-20 ℃低温冰箱、-80 ℃超低温冰箱Panasonic/日本松下；自动高压蒸汽灭菌器 上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；电热恒温培养箱、真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；超纯水系统 默克化工技术有限公司；移液器 德国Eppendorf；ZX-60XZX 上海知信雪花制冰机 上海知信实验仪器技术有限公司；SpectraMax M3 全波长酶标仪 美国Molecular Devices 公司；紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；GA-3 型血糖试条、GA-3 型血糖仪、一次性使用末梢采血针 三诺生物传感股份有限公司；高速匀浆器 天津恒奥科技发展有限公司；生物组织包埋机、RM2015 切片机、DM 500 光学显微镜 德国Leica。

1.2 实验方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的建立 取6 周龄，体重20～25 g 雄性昆明小鼠65 只适应性喂养1 周（（24±1）℃、12 h 昼/夜循环），使用正常饲料饲喂小鼠。观察生长情况，自由饮食饮水。随机抽样的方法，将小鼠分正常组（基础饲料饮食组10 只）、实验组（高脂饲料饮食组55 只），喂养4 周。禁食不禁水8 h 后称量小鼠体重，根据体重计算STZ 注射量。实验组连续3 d 腹腔注射STZ 缓冲液（50 mg/kg），注射体积为0.5 mL/100 g，正常组注射同剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，造模期间自由摄食、饮水。待稳定72 h 后禁食不禁水8 h，用血糖仪以尾静脉针刺的采血方法，测定小鼠的空腹血糖（FBG），选取空腹血糖值大于11.1 mmol/L 的小鼠进行实验。

1.2.2 动物分组及给药 将造模成功的小鼠随机分为5 组，参考文献等效剂量换算，分组及灌胃给药情况如下：正常对照组8 只（Normal Control Group，NC）、模型对照组8 只（DM）灌胃等量生理盐水；阳性药物组8 只（Metformin，MET）灌胃250 mg/kg 盐酸二甲双胍溶液；蓝莓花青素低剂量组（BA-L）、中剂量组（BA-M）和高剂量组（BA-H）分别灌胃100、200、300 mg/kg 蓝莓花青素。灌胃时以0.1 mL/10 g为标准进行灌胃，每周根据每只小鼠的体重调整灌胃剂量，连续给药4 周。灌胃4 周后，将小鼠禁食过夜，称量体重，随后进行眼眶取血，用10 mL 离心管收集小鼠血液1～2 mL，静置4 h 后，用离心机4000 r/min离心15 min，取上层血清，分装于-20 ℃冰箱保存，用于各项指标的测定。采血后，将所有小鼠脱臼处死。

1.2.3 检测指标

1.2.3.1 肝、肾脏器指数的测定 解剖小鼠，取出小鼠肝脏、肾脏组织，观察组织情况。用生理盐水冲洗后滤纸吸去水分后称重，获得脏器质量。肝脏、肾脏的脏器指数按如下公式计算。

1.2.3.2 肝、肾功能指标的测定 同1.2.2 取血清。根据试剂盒检测说明书，采用酶标仪检测血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性，尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）含量。

1.2.3.3 肝、肾组织抗氧化指标测定 将处理后的肝脏、肾脏放入-80 ℃冰箱，用于相关指标的测定。测定时从-80 ℃冰箱将小鼠肝、肾组织取出，与0.9%生理盐水按照1:9 的比例混合，制成10%组织匀浆液，离心机4000 r/min 离心10 min，取组织匀浆上清液，待用。分别取肝肾组织的匀浆上清液测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA），测定过程严格按照试剂盒检测说明书进行操作。

1.2.3.4 肝、肾组织病理学观察 将处理好的肝脏、肾脏在4%多聚甲醛中固定24 h 后取出，用低浓度到高浓度的酒精进行梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、常规石蜡包埋、组织切片、脱蜡、HE 染色，封片后于光学显微镜下观察肝细胞、肾细胞的形态、组织结构等病理学变化。

1.3 数据处理

采用SPSS 25.0 软件对实验数据进行统计分析，所有数据均表示为平均值±标准差（x ¯±s）。用Graph-Pad Prism 8.0 软件进行图片绘制。进行单因素方差分析（ANOVA）、检验或Sidak 的多重比较检验以确定不同组之间的统计差异。在＜0.05 时表示差异显著，＜0.01 时表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肝、肾脏器指数的影响

机体的正常生理活动与组织器官息息相关，各组织器官的重量也与相关疾病相关联。正常状态下，小鼠的脏器指数较稳定，一旦组织受到损伤，脏器指数也会随之变化。长期的高脂饮食将会使体内激素分泌紊乱，致使肝脏、肾脏负担加重，进而导致肝肾损伤或者肿大等现象的发生，同时2 型糖尿病引起的炎症反应也会致使脏器指数上升。因此，通过脏器指数可以帮助了解组织器官的健康状态。

模型组小鼠的肝脏、肾脏组织与正常组相比明显肿大。由图1 可得出，模型组小鼠脏器指数极显著增加（＜0.01），说明糖尿病小鼠肝肾组织存在一定损伤。灌胃四周后，与模型组相比，蓝莓花青素低、中、高剂量组肝肾脏器指数均明显下降，肝脏指数分别下降了7.30%、9.66%、15.38%，肾脏指数分别下降了7.19%、11.38%、16.17%，说明蓝莓花青素可抑制糖尿病小鼠肝脏和肾脏的肿大，且在剂量范围内，蓝莓花青素的剂量浓度越大，抑制肝肾肿大的效果越好。

图1 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠脏器指数的影响Fig.1 Effect of blueberry anthocyanin on viscera index in type 2 diabetic mice

2.2 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肝功能、肾功能的影响

2.2.1 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肝脏功能的影响 肝脏是机体代谢的主要场所和胰岛素抵抗的重要靶器官。保护肝脏的正常功能对缓解机体胰岛素抵抗、控制糖尿病的发展具有重要意义。评价肝脏损伤的标志物和肝细胞功能的指标主要有谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT），血清中ALT、AST 活性增加则意味着肝脏受到损伤。

由图2 可知，模型组小鼠血清ALT、AST 活性与正常组相比极显著升高（＜0.01），说明2 型糖尿病小鼠的肝细胞功能受到破坏。二甲双胍和蓝莓花青素干预后，与模型组相比，二甲双胍组ALT、AST 活性均极显著降低（＜0.01）；蓝莓花青素低、中、高剂量组ALT 活性、AST 活性极显著下降（＜0.01），ALT下降14.71%、25.25%、41.61%，AST 下降27.96%、36.13%、45.35%，说明蓝莓花青素对两个肝功能重要指标ALT、AST 有明显改善作用，进而表明蓝莓花青素对STZ 引起的肝损伤具有潜在的保护作用。

图2 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肝脏功能的影响Fig.2 Effects of blueberry anthocyanins on liver function in type 2 diabetic mice

2.2.2 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肾脏功能的影响 肌酐在体内进行代谢分解，其产物主要就是血肌酐（Scr），蛋白质在体内进行分解代谢后的终端产物即为尿素氮（BUN）。糖尿病肾病的临床表现之一就是血清中血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）含量升高，当Scr 和BUN 含量明显高于正常值时，肾功能受到严重损害。因此，Scr 和BUN 可作为检测肾功能变化的重要指标。

由图3 可知，与正常组相比，模型组小鼠血清血肌酐和尿素氮含量极显著上升（＜0.01），说明模型组小鼠肾功能可能出现破坏。经蓝莓花青素灌胃4 周后，蓝莓花青素低、中、高剂量组小鼠Scr 与模型组相比均存在下降趋势（＜0.05），且随着蓝莓花青素浓度的增加，下降幅度越大；蓝莓花青素低、中、高剂量组BUN 含量分别下降10.8%、18.98%、31.27%，高剂量组BUN 下降趋势最为显著（＜0.01），表明蓝莓花青素在保护肾功能上有一定的功效。

图3 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肾脏功能的影响Fig.3 Effects of blueberry anthocyanins on kidney function in type 2 diabetic mice

2.3 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肝脏、肾脏抗氧化能力的影响

2.3.1 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肝脏抗氧化能力的影响 器官损伤通常是由氧化应激引起的，氧化应激是指机体内自由基的产生与清除失衡时，产成过量的自由基而导致细胞坏死、组织损伤、能量代谢异常等不良反应。肝脏在代谢时易产生大量的自由基，这可能会导致脂质过氧化、抗氧化酶的消耗和胰岛素抵抗，甚至更严重的组织损伤。因此，改善机体肝脏组织的氧化应激状态，对改善肝功能、修复肝损伤、减少脂质的过氧化进而改善糖尿病并发症具有重要意义。

图4 显示了各组小鼠肝脏组织MDA 含量与SOD、GSH-Px 活性。由图4（a）可知，STZ 诱导的糖尿病小鼠肝脏MDA 含量与正常组小鼠相比极显著上升（＜0.01），表明糖尿病小鼠肝脏发生氧化损伤。同时，蓝莓花青素的干预一定程度上降低了MDA 的含量，说明蓝莓花青素可改善糖尿病小鼠的氧化损伤，保护肝脏功能。为更进一步探究蓝莓花青素减缓肝脏氧化损伤的机制，试验还评价了蓝莓花青素对肝脏抗氧化酶系的影响。如图4（b）、4（c）所示，模型组小鼠肝脏SOD 和GSH-Px 活性极显著低于正常组（＜0.01）。经不同剂量的蓝莓花青素处理可显著增强抗氧化酶的活性。高剂量组小鼠肝脏的SOD 和GSH-Px 活性最强，比模型组高25.22%、20.03%（＜0.01）；低剂量组也比模型组高17.07%、8.48%（＜0.05）。综合分析可知，蓝莓花青素可通过提高SOD、GSH-Px 活性来减缓肝脏的氧化应激作用，从而降低脂质过氧化程度，修复肝脏损伤。

图4 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肝脏抗氧化能力的影响Fig.4 Effects of blueberry anthocyanins on liver antioxidant capacity of type 2 diabetic mice

2.3.2 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肾脏抗氧化能力的影响 丙二醛（MDA）是自由基氧化反应的终产物，也是脂质过氧化损伤的重要标志，一定程度上反映了糖尿病的机理。图5（a）显示，模型组小鼠肾脏MDA 含量与正常组相比极显著升高（＜0.01），说明模型组小鼠存在脂质过氧化现象。灌胃给药四周后，与模型组相比，蓝莓花青素低、中、高剂量组MDA 水平分别下降11.29%、22.98%、30.65%，说明蓝莓花青素能够减少小鼠肾组织中MDA 含量，减缓脂质过氧化程度，且随着浓度的增高，效果愈加明显。

图5 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肾脏抗氧化能力的影响Fig.5 Effects of blueberry anthocyanins on kidney antioxidant capacity of type 2 diabetic mice

机体内主要的抗氧化酶有SOD 和GSH-Px。SOD 是机体唯一能淬灭自由基的酶，可直接使超氧阴离子分解成水和氧，阻碍脂质过氧化的产生，减少机体损伤；GSH-Px 能使过氧化物转化成羟基化合物，阻止过氧化物对细胞膜功能及结构的损害。由图5（b）和图5（c）可知，造模成功后，模型组小鼠肾组织SOD、GSH-Px 的活性与正常组相比极显著下降49.82%和34.66%（＜0.01）。蓝莓花青素治疗后，各给药组小鼠SOD、GSH-Px 活性与模型组相比均有所上升，其中高剂量组SOD 活性升高34.23%、GSH-Px活性升高25.62%（＜0.01），说明蓝莓花青素能改变糖尿病小鼠肾组织SOD 和GSH-Px 活性降低的现象，对肾脏中的氧化应激表现出较强的抑制作用。

2.4 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肝肾组织的影响

2.4.1 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肝脏组织的影响 通过HE 染色观察蓝莓花青素对糖尿病小鼠肝脏组织形态的影响。图6 呈现了灌胃4 周后，不同组小鼠肝细胞形态和结构的差异。由图可知，正常组小鼠肝细胞是以中央静脉为中心向四周排列的，细胞结构清晰完整，间隙正常，边界分明，细胞核形态正常，肝细胞无明显病变。与正常组相比，模型组小鼠肝细胞中央静脉结构混乱不完整，胞浆内出现大量脂肪空泡，出现淤血现象，肝索和肝窦排列不规则，细胞核大小不一，细胞与细胞之间界限不清，说明STZ 诱导的糖尿病小鼠产生了严重的肝脏损伤。显微镜观察显示，通过蓝莓花青素的干预可明显改善糖尿病小鼠肝脏的脂肪空泡性、肝细胞的结构，同时使组织中肝细胞数目增加。高剂量蓝莓花青素的干预对糖尿病小鼠肝组织损伤修复最好，改善效果最为明显。结合肝功能的测定结果综合分析，蓝莓花青素具有改善肝组织细胞形态，修复肝细胞损伤的作用，且高剂量的蓝莓花青素显示更佳的修复作用。

图6 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肝脏组织的影响Fig.6 Effects of blueberry anthocyanin on liver tissue of type 2 diabetic mice

2.4.2 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肾脏组织的影响 为了更直观地观察糖尿病小鼠肾脏的组织损伤情况，给药4 周后，将各组小鼠的肾脏进行组织病理学切片并染色，如图7 所示。正常组小鼠肾脏组织结构清晰，细胞分布均匀、排列正常，肾小球基底膜未见异常，肾小囊体积、囊腔间隙正常。与正常组相比，模型组小鼠肾脏结构不清晰，肾小球内部细胞增多、体积变大且界限不明，肾小囊囊腔间隙变小，基底膜增厚且系膜基质增生，还伴有炎性细胞的侵润。说明糖尿病小鼠的肾脏组织发生了严重的损伤。经蓝莓花青素治疗后，各剂量组小鼠肾脏的病变情况均有所改善，其中高剂量组改善效果更为明显，肾小球、肾小管形状有所缓解，结构较为规则清晰，基底膜恢复正常，囊腔间隙缩小，炎性细胞浸润情况稍有改善。

图7 蓝莓花青素对2 型糖尿病小鼠肾脏组织的影响Fig.7 Effect of blueberry anthocyanin on renal tissue of type 2 diabetic mice

3 讨论与结论

常见的糖尿病并发症有糖尿病肝病和糖尿病肾病。糖尿病肝病主要特征为肝内脂肪滴增多、肝糖原沉积、肝细胞水肿且出现脂肪空泡等。糖尿病肾病的主要特征是肾小球肥大、肾小球和肾小管结构和功能发生改变、肾脏纤维化等。前期研究了蓝莓花青素对糖尿病小鼠的降糖降脂作用，结果显示良好，且糖尿病会引发肝肾损伤，因此，在降血糖、降血脂的基础上研究蓝莓花青素对肝肾损伤的修复作用具有重要意义。

组织器官损伤与糖尿病密切相关。本研究中，在高脂、高糖的饲养条件下，小鼠出现肝、肾脏器官肿胀。经过4 周干预后，蓝莓花青素组糖尿病小鼠肝脏、肾脏指数显著降低，肝组织形态、肝索和肝窦排列显著改善，肾脏的肿大和损伤、肾小球、肾小管组织状态、囊腔腔隙等得到明显改善，说明蓝莓花青素能够修复高血糖导致的肝脏、肾脏的组织损伤。Lee 等研究发现富含花青素的冻干蓝莓粉能有效地控制高脂膳食小鼠的肝脏重量和功能损伤，这与本研究结果一致。

血液与动物体内的大部分组织直接接触，病理变化很可能反映在血液样本中某些蛋白质和酶的水平上。血清中ALT 和AST 的增强已在临床上用作肝损伤生化标志物，BUN 和Scr 也在临床上被广泛用于反映肾脏的状况。在本研究中，ALT 和AST 活性的变化以及血清BUN 和Scr 水平的变化受到蓝莓花青素的影响，表明蓝莓花青素对糖尿病小鼠的肝肾功能具有改善作用，这与景志行的研究结果一致。在糖尿病的发展中，机体内细胞的过度氧化应激起着重要作用，持续性的高血糖也可能导致体内氧化应激增加。因此，抑制或减少氧化应激可能是预防或延缓糖尿病发病率的一种治疗方法。据报道，糖尿病小鼠肝脏和肾脏中的抗氧化酶活性明显降低，如GSH-Px 和SOD，花青素在高氧化应激条件下（如糖尿病、肥胖症和高胆固醇血症）可能具有抗氧化能力，这与本文目前的结论一致。在用蓝莓花青素干预后，酶活性增加和MDA 水平的降低，表明蓝莓花青素可抑制肝脏、肾脏组织的氧化损伤和脂质过氧化。

综上所述，蓝莓花青素可显著提高2 型糖尿病小鼠肝脏、肾脏的抗氧化能力，改善2 型糖尿病小鼠肝脏和肾脏的功能，修复高血糖对肝、肾组织细胞的损伤。这些结果为蓝莓花青素作为一种能够预防和缓解2 型糖尿病的潜在的天然功能性食品成分提供了理论基础。