抑菌性桑枝低聚糖微胶囊的制备及结构表征

朱巧玲，邹宇晓，廖森泰，孙远明，黎尔纳,

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，农业农村部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610）

桑枝（）是桑树的干燥枝条，富含多糖、黄酮、生物碱和氨基酸等功能性成分，是传统中药，同时也被列入可用于保健食品的物品名单中。其中多糖是桑枝的主要活性物质，具有抗菌、抗炎、降低血糖、保护肝脏等药理作用。天然植物多糖降解为低聚糖后，生理活性能够得到有效提高，Qin 等降解燕麦-葡聚糖得到低聚糖片段，发现其对金黄色葡萄球菌的抑菌活性得到明显增强；吴婷等利用葫芦巴多糖酶解得到半乳糖甘露聚糖片段，同样增强了多糖的抑菌活性。变异链球菌是公认的主要致龋菌，可以利用蔗糖等碳水化合物产生不溶性葡聚糖，覆盖在牙齿表面形成齿垢，在齿垢中使糖发酵产酸，腐蚀牙齿，形成龋齿。抑制变异链球菌可以有效防治龋齿。前期课题组发现经-葡聚糖酶酶解制备的桑枝低聚糖对变异链球菌的抑制率较桑枝多糖显著升高，但桑枝低聚糖吸湿性强，易结块，这限制了其进一步应用。因此有必要通过微胶囊化包埋桑枝低聚糖，提高抑菌物质的稳定性，延长储藏期。

微胶囊技术利用高分子化合物的成膜性，将芯材连续、完全地包覆起来，形成直径为1～5000 μm 的固体颗粒，可以达到改善芯材物理性质和保护活性成分的目的。常用的微胶囊化方法有喷雾干燥法、喷雾冷却法、冷冻干燥法和复凝聚法等，其中喷雾干燥法可以瞬间完成传热和传质的过程，适用于多糖等热敏性物质的微囊化。壁材影响微胶囊的表面形态和稳定性。麦芽糊精溶解性好，被广泛用于微胶囊壁材，但乳化性和成膜性较差，因此需要将麦芽糊精与其他具有良好乳化性和成膜性的材料结合使用。Shao 等以麦芽糊精-乳清蛋白为壁材，制备出具有良好形貌和热力学稳定性的灵芝多糖微胶囊。众多学者采用喷雾干燥法制备银耳多糖微胶囊、菲律宾蛤仔蒸煮多糖微胶囊、仙人掌多糖微胶囊等，改善了多糖吸湿性强、特殊气味、分散性差等不良物理性质，促进了天然多糖的应用。

将功能活性物质制备成微胶囊并添加到食品中，以期得到额外的健康益处成为研究热点，但是对于桑枝多糖及桑枝低聚糖的微胶囊化少有研究。本研究以致龋菌变异链球菌的抑菌率为指标，优化喷雾干燥法制备桑枝低聚糖微胶囊工艺，并对微胶囊的结构、形态、热力学性能与贮藏稳定性进行评价，旨在提高桑枝低聚糖的生物利用度，为桑枝低聚糖微胶囊在功能性食品基料和日化口腔护理配料中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑枝多糖 质量分数为70%，实验室自制；-葡聚糖酶（50 U/mg） 广州市齐云生物技术有限公司；麦芽糊精 生化试剂，上海源叶生物有限公司；阿拉伯胶、乳清蛋白（纯度80%）、大豆蛋白、酪蛋白酸钠生化试剂，罗恩科技（北京）有限公司；变异链球菌（，ATCC25175） 广东省微生物研究所菌种保藏中心；脑-心浸萃液态培养基（brain heart infusion，BHI） 广东环凯微生物科技有限公司；其他试剂 均为分析纯。

DSC1 型差示扫描量热仪 瑞士Mettler-Toledo公司；VERTEX 70 型傅里叶变换红外光谱仪 德国Bruker 公司；3400N 型扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；D8 Advance 型X 射线多晶衍射仪 德国布鲁克AXS 公司；T18 型高速剪切机 美国IKA 公司；LA-960S 型激光散射粒度分布分析仪 日本HORIBA公司；DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；85-2 型数显恒温磁力搅拌器常州朗越仪器制造有限公司；ADL311 型喷雾干燥机 日本YAMATO 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桑枝多糖的制备 参照Yu 等的方法，称取干燥的桑枝粉末，按料液比1:40 加入去离子水，在80 ℃水浴中超声处理50 min，离心（4 ℃，10000 r/min，5 min），收集上清液。减压抽滤，旋蒸浓缩，加入四倍体积的95%乙醇溶液，4 ℃静置过夜，离心（4 ℃，10000 r/min，5 min），收集沉淀，得到桑枝多糖，经苯酚-硫酸法检测多糖质量分数约为70%。

1.2.2 桑枝低聚糖的制备 根据本课题组前期实验数据及方法，添加485 U·mL-葡聚糖酶到桑枝多糖溶液中，44 ℃水浴3.6 h，沸水浴灭酶10 min，离心（4 ℃，4000 r/min，10 min），收集上清液即为桑枝低聚糖（oligosaccharides，RMOS）。

1.2.3 桑枝低聚糖微胶囊的制备 参照Shao 等的方法并略加修改。总固形物含量为壁材与芯材所占混合溶液的质量分数。确定总固形物含量为20%，按配方要求的质量比称取壁材、芯材、去离子水。分别将麦芽糊精（maltodextrin，MD）、阿拉伯胶（gum arabic，GA）、大豆蛋白（soy protein isolate，SPI）、乳清蛋白（whey protein isolate，WPI）、酪蛋白酸钠（sodium caseinate，NaCas）溶于去离子水中形成溶液，搅拌（50 ℃，300 r/min，30 min）。按配方将壁材溶液混合，搅拌（50 ℃，300 r/min，30 min）。然后缓慢在复合壁材溶液中加入桑枝低聚糖溶液，搅拌（50 ℃，300 r/min，2 h）。混合溶液经10000 r/min 高速剪切5 min，喷雾干燥制得微胶囊。设置喷雾干燥器工作条件：进风温度170 ℃，出风温度60 ℃，喷嘴直径0.7 mm，泵速3 mL/min，风速为473 L/h。以未经包埋的桑枝低聚糖与未添加芯材的空胶囊作为对照。

1.2.4 抑菌率的测定 将喷雾干燥所得粉末样品溶于BHI 培养基，配制终质量浓度为24.00 mg/mL 的桑枝低聚糖BHI 培养基，灭菌后按1%（v:v）接种变异链球菌，37 ℃厌氧培养24 h，测定抑菌率，计算方法见式（1）。变异链球菌活菌数量的测定：稀释倒平板法，参考GB 4789.2-2016 菌落总数测定方法。接种1%菌液，37 ℃厌氧培养24 h，以BHI 液体培养基为阴性对照组，将阴性对照组活菌总数设置为100%。

1.2.5 吸湿性的测定 参照Subtil 等的方法，称取约1 g 粉末样品于称量瓶中，25 ℃下开盖置于底部装有过饱和NaCl 溶液（RH 75.0%）的干燥器中。24 h 后样品称重，吸湿性计算公式见式（2）。

1.2.6 桑枝低聚糖微胶囊制备工艺的优化

1.2.6.1 不同壁材对微胶囊抑菌率的测定 在壁材比例为1:1，芯材-壁材质量比为1:3 的条件下，分别将麦芽糊精与阿拉伯胶、大豆蛋白、乳清蛋白、酪蛋白酸钠按质量比1:1 混合，喷雾干燥制得微胶囊。考察壁材种类对抑菌率的影响。

1.2.6.2 壁材比例对微胶囊抑菌率的测定 确定壁材种类为麦芽糊精与乳清蛋白，在芯壁比为1:3 的条件下，分别配制壁材比例为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3 的混合溶液，喷雾干燥制得微胶囊。考察壁材比例对抑菌率的影响。

1.2.6.3 芯壁比对微胶囊抑菌率的测定 确定壁材种类为麦芽糊精与乳清蛋白，在壁材比例为2:1 的条件下，分别配制芯壁比为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5 的混合溶液，喷雾干燥制得微胶囊。考察芯壁比对抑菌率的影响。

1.2.6.4 芯壁比对微胶囊吸湿性的测定 确定壁材种类为麦芽糊精与乳清蛋白，在壁材比例为2:1 的条件下，分别配制芯壁比为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5 的混合溶液，喷雾干燥制得微胶囊。考察芯壁比对吸湿性的影响。

1.2.7 桑枝低聚糖微胶囊微观结构的观察 通过扫描电镜观察微胶囊表面形态。使用导电胶将桑枝低聚糖微胶囊以及桑枝低聚糖粉末样品黏在样品台上，喷金处理后，使用扫描电镜在5 kV 加速电压下观察粉末样品形态。

1.2.8 桑枝低聚糖微胶囊粒径的测量 参照Chen等的方法，使用激光粒度仪测定桑枝低聚糖和微胶囊的平均粒径和粒径分布。将粉末样品分散在异丙醇中，测量粒度分布。IPA 的折射率设置为1.378，固定迭代次数为15。

1.2.9 桑枝低聚糖微胶囊红外光谱的测定 分别称取1 mg 的桑枝低聚糖、微胶囊和空胶囊粉末样品，与100 mg 的KBr 混合并压片，以KBr 空白压片作参比，在波长为4000～400 cm范围内测定其红外光谱，分辨率为4 cm。测定过程中累计16 次扫描信号得到样品的红外光谱图。

1.2.10 桑枝低聚糖微胶囊X 衍射的测定 分别称取0.5 g 桑枝低聚糖、微胶囊和空胶囊粉末样品置于样品盒内，将样品压片并固定。使用X 射线多晶衍射仪进行测定，测定条件：靶材Cu、Ka，测定电流40 mA，测定电压40 kV，扫描范围5°～80°（2θ）；步宽0.02°；扫描方式连续。

1.2.11 桑枝低聚糖微胶囊DSC 的测定 参照杨诗沅等的方法略加修改。用差式热扫描量热仪（DSC）分别对桑枝低聚糖、微胶囊和空胶囊进行热稳定性测定。称取粉末样品约3 mg，压片，以空坩埚为参比。检测条件为：温度范围30～300 ℃，升温速率10 ℃/min，N流速20 mL/min。

1.2.12 桑枝低聚糖微胶囊贮藏稳定性的测定 参照鲍杰的方法并略加修改。将桑枝低聚糖和微胶囊装入透明的聚丙烯塑料袋，密封后分别置于恒温烘箱（40、60 °C）以及底部盛有过饱和NaCl 溶液（RH 75.0%）和过饱和KNO溶液（RH 92.5%）的干燥器中，每隔一周测定桑枝低聚糖含量，考察温度与湿度对稳定性的影响。桑枝低聚糖含量采用苯酚-硫酸法测定，桑枝低聚糖保留率计算方法见式（3）。

1.3 数据处理

试验数据均为3 次重复平均值。采用Graph Pad Prism 7、Origin 2019 和SPSS 22.0 进行数据统计处理。

2 结果与分析

2.1 桑枝低聚糖微胶囊制备工艺的优化

桑枝低聚糖微胶囊制备过程中，壁材种类、壁材比例、芯材-壁材质量比对微胶囊抑菌率与吸湿性的影响，实验结果见图1。桑枝低聚糖对变异链球菌有抑制作用，抑菌率可以反映抑菌物质桑枝低聚糖的装载效果。壁材种类对微胶囊抑菌率的影响见图1A，麦芽糊精与乳清蛋白作为壁材制得的桑枝低聚糖微胶囊抑菌率为51.78%±2.29%，显著高于其他组（0.05）。壁材的选择直接影响微胶囊的功能特性、工艺条件和成本。麦芽糊精具有良好的溶解性，低粘度，但是成膜性较差，而阿拉伯胶、大豆蛋白、乳清蛋白和酪蛋白酸钠具有良好的成膜性，广泛应用于食品材料中。本实验将麦芽糊精与之复配制备微胶囊，发现麦芽糊精与乳清蛋白复配制备的微胶囊抑菌率最高，装载效果最好。这可能是因为乳清蛋白溶解性好，与麦芽糊精结合程度高，并且存在亲水性和疏水性氨基酸，使得装载效率大幅提高。所以选择麦芽糊精和乳清蛋白作为壁材。

壁材比例对微胶囊抑菌率的影响见图1B，抑菌率随着麦芽糊精用量增多呈现出先升高后降低的趋势。麦芽糊精与乳清蛋白的比例为2:1 时，微胶囊的抑菌率达到57.50%±4.37%，显著高于其他组（0.05）。麦芽糊精用量过少，液滴表面的成膜性较差，导致壁材包封能力减弱。而乳清蛋白用量过多，壁材疏水性增加，样品粘度增大，不利于微胶囊的形成。因此确定壁材比例2:1 进行下一步优化。

桑枝低聚糖极易在空气中吸水受潮，经包埋后吸湿性有效降低。黄晓梅等制备的大豆蛋白酶解产物微胶囊较未经包埋的酶解产物吸湿性降低了1.60 倍。芯壁比越高，微胶囊装载的桑枝低聚糖越多，抑菌效果越好，但是有限的壁材无法完全包裹住桑枝低聚糖，导致微胶囊外壳较薄，甚至部分桑枝低聚糖外露，在空气中吸水结块，微胶囊的吸湿性增加，产品稳定性降低。芯壁比越低，微胶囊外壁较厚，有效降低吸湿性的同时也降低了微胶囊的抑菌率，微胶囊化效率降低，装载的低聚糖较少，有效抑菌物质较少，使得抑菌效果大打折扣。因此需要综合考虑微胶囊的抑菌率与吸湿性，确定最佳芯壁比。芯壁比对微胶囊抑菌率和吸湿性的影响见图1C～图1D。芯壁比为1:2 时，微胶囊具有较高的抑菌率61.31%±3.34%，较低的吸湿性12.31%±1.28%，与其他组均存在显著性差异（0.05），芯材和壁材都能得到有效利用，确定此为最佳工艺。

图1 壁材种类、壁材比例、芯材-壁材质量比对微胶囊抑菌率与吸湿性的影响Fig.1 Effect of wall material type,wall material ratio,core material-wall material mass ratio on the antibacterial rate and hygroscopicity of microcapsule

综上结果，桑枝低聚糖的最佳制备工艺为：麦芽糊精与乳清蛋白作为壁材，质量比为2:1，芯壁比为1:2。后续进行结构表征的微胶囊均在为此条件下制备得到。

2.2 桑枝低聚糖微胶囊的微观形貌分析

桑枝低聚糖及微胶囊不同倍数下的扫描电镜图见图2。喷雾干燥后，样品整体呈球形，表面存在凹陷，有大量微粒附聚。桑枝低聚糖的表面凹陷严重，发生黏连，部分微粒出现孔洞；而微胶囊的表面光滑平整，结构较为饱满充实，少量表面有凹陷，较为疏松、分散。

图2 桑枝低聚糖、微胶囊的扫描电镜图Fig.2 SEM micrographs of Ramulus mori oligosaccharides and microcapsules

在喷雾干燥过程中，样品因为水分快速蒸发而发生缩聚，导致表面出现皱褶。桑枝低聚糖由于高吸湿性而呈现附聚，表面成膜性差而导致孔洞。微胶囊的壁材具有较强的界面吸附能力，起到较好的支撑作用，减弱了表面凹陷，并且使得液滴粘度下降，有助于形成均匀度高的微胶囊。微胶囊表面附聚着的小颗粒，可能是尚未被完全包封的芯材。扫描电镜观察结果表明，微胶囊具有较好的表面形态和品质，可以实现对桑枝低聚糖的有效包埋。本实验制备的微胶囊表面形貌与Karrar 等采用麦芽糊精、阿拉伯胶和乳清分离蛋白作为壁材经喷雾干燥制备的西瓜籽油微胶囊相似，具有喷雾干燥粉末的典型特征。

2.3 桑枝低聚糖微胶囊粒径分析

粒径及其分布状态是评价微胶囊品质的重要参数，较大的粒径会影响微胶囊的外观、分散性、流动性，并且延长活性物质的释放时间。桑枝低聚糖与微胶囊的粒径分布见图3。如图3 所示，低聚糖的平均粒径为8.86±2.24 μm，粒径分布在6.12～17.34 μm之间；微胶囊的平均粒径为6.58±1.76 μm，粒径分布在4.45～13.22 μm 之间。形成微胶囊后，粒径减小，大小均匀。可能是因为桑枝低聚糖自身容易发生团聚，与壁材作用形成微胶囊后，减弱了自身团聚作用，从而有效降低颗粒的平均粒径大小，使得粒径分布相对集中。本实验制备的微胶囊粒径小于锐孔法制备的洋葱黄酮微胶囊0.6 mm、复凝聚法制备的西番莲果皮花色苷微胶囊12.15 μm和喷雾干燥制备的佛手提取物微胶囊14.34 μm。

图3 桑枝低聚糖、微胶囊的粒径分布图Fig.3 Particle size distributions of Ramulus mori oligosaccharides and microcapsules

2.4 桑枝低聚糖微胶囊结构分析

2.4.1 桑枝低聚糖微胶囊红外光谱分析 傅里叶变换红外光谱可以显示物质的分子结构和特征化学键，从而证明微胶囊的组成物质之间是否存在相互作用。桑枝低聚糖微胶囊及组成成分的红外光谱见图4。由图4 可以看出，与桑枝低聚糖相比，微胶囊在3378.01 cm附近由于O-H 键拉伸振动形成的吸收峰、在1649.77 cm附近由于C=O 不对称拉伸振动形成的吸收峰、在1414.11 cm附近由于CH和C-H 拉伸振动引起的吸收峰以及1025.93 cm处CO-O 键的不对称拉伸振动引起的吸收峰均呈现出明显减弱，这可能是由于桑枝低聚糖进入微胶囊内部后振动受限所引起的。微胶囊在2928.97 cm附近的吸收峰加强，证明了内部氢键的存在。与空胶囊对比，微胶囊没有出现新的特征峰，充分说明包埋是通过静电相互作用形成的，而非通过化学相互作用联接，壁材与芯材没有发生化学反应，保证了芯材的天然性与完整性。孙亚利等对苦荞黄酮的包埋也发现类似的结果，苦荞黄酮微胶囊的红外光谱图中未出现壁材和芯材中没有的特征峰，包埋过程中未出现新的化学键。

图4 桑枝低聚糖、空胶囊及微胶囊的红外光谱图Fig.4 FTIR spectra of Ramulus mori oligosaccharides,empty microcapsules and microcapsules

2.4.2 桑枝低聚糖微胶囊X 衍射分析 微胶囊结晶度与稳定性有关，通过X 衍射可以确定物质的晶型结构。桑枝低聚糖、空胶囊与微胶囊的X 衍射图见图5。桑枝低聚糖在衍射角（2θ）28.36°、31.69°、40.56°和45.41°处有较为尖锐的衍射峰，证明其以结晶形式存在；空胶囊在18.31°处有弥散的宽峰，桑枝低聚糖微胶囊在19.27°处有强度较高的弥散宽峰，证明空胶囊与微胶囊均为非晶型结构。未观测到桑枝低聚糖的特征衍射峰，表明桑枝低聚糖被完全包埋在微胶囊内部，并非简单物理混合，证明桑枝低聚糖微胶囊成功制备。廖霞等采用壳聚糖和海藻酸钠作为壁材，包埋槲皮素制备微胶囊，同样通过XRD 分析证明壁材的静电相互作用对槲皮素的结晶性质、结晶能力产生了影响，使得槲皮素由结晶结构转变为无定形结构。

图5 桑枝低聚糖、空胶囊及微胶囊的XRD 图Fig.5 X-ray diffraction spectra of Ramulus mori oligosaccharides,empty microcapsules and microcapsules

2.4.3 桑枝低聚糖微胶囊DSC 分析 玻璃态转变温度是产品长期储存期间稳定性的指标，产品贮藏温度必须低于玻璃态转变温度。桑枝低聚糖、空胶囊和微胶囊的DSC 结果如图6 所示，从图6 中可以看出，制备为微胶囊后，桑枝低聚糖的玻璃态转变温度从79.30 ℃提高到96.10 ℃，热稳定性得到提升，在室温下可保持在稳定的玻璃态。麦芽糊精与乳清蛋白形成了具有强网络结构的凝聚体，使得微胶囊外壁结构致密，通透性较小，有效保护芯材稳定。这与田媛研究发现姜粉经包埋后玻璃化转变温度升高，贮藏稳定性提高的结果一致。

图6 桑枝低聚糖、空胶囊及微胶囊的DSC 曲线Fig.6 DSC curves of Ramulus mori oligosaccharides,empty microcapsules and microcapsules

2.5 桑枝低聚糖微胶囊贮藏稳定性分析

2.5.1 温度对桑枝低聚糖微胶囊稳定性的影响 温度对桑枝低聚糖及微胶囊稳定性的影响结果见图7。桑枝低聚糖及微胶囊在40.0 ℃环境中贮藏的保留率见图7A，贮藏5 周后，微胶囊和桑枝低聚糖的保留率较高；在60.0 ℃环境中的保留率见图7B，高温下微胶囊和桑枝低聚糖损失较多，保留率分别为66.65%±5.84%和42.75%±3.46%；相同的热环境下，微胶囊化产品的保留率明显高于桑枝低聚糖，因为微胶囊化的桑枝低聚糖受壁材的保护，有效避免了高温降解。这与张亚杰等通过微胶囊化提高柚皮苷和柠檬苦素稳定性的结果一致，在高温条件下微胶囊化对桑枝低聚糖具有较好的保护效果。

图7 温度对桑枝低聚糖、微胶囊稳定性的影响Fig.7 Effect of temperature on the stability of Ramulus mori oligosaccharides and microcapsules

2.5.2 湿度对桑枝低聚糖微胶囊稳定性的影响 湿度对桑枝低聚糖及微胶囊稳定性的影响见图8。由图8A～图8B 可知，桑枝低聚糖及微胶囊在RH 75.0%和RH 92.5%环境中的保留率均随着时间的增加而显著降低。桑枝低聚糖在RH 92.5%的条件下贮藏5 周后保留率最低，仅为33.45%±2.86%，稳定性最差。相同条件下桑枝低聚糖微胶囊的保留率明显提高，达到62.90%±7.94%。壁材的存在有效隔绝了桑枝低聚糖与空气中的水接触，从而防止桑枝低聚糖氧化降解。舒予发现五味子多糖在25 ℃、RH 75%的环境下储藏1 d，吸湿性为14.62%，经壳聚糖包埋成五味子多糖微囊后，吸湿性降低为9.59%，有效降低了五味子多糖的吸湿性，与本实验结果一致。结果表明微胶囊化可以有效提高桑枝低聚糖在高湿环境下的稳定性，延长桑枝低聚糖的货架期。

图8 湿度对桑枝低聚糖、微胶囊稳定性的影响Fig.8 Effects of relative hurnidity on the stability of Ramulus mori oligosaccharides and microcapsules

3 结论

桑枝低聚糖具有抑制致龋菌变异链球菌的特殊作用，可有效防治龋齿，但是具有较高的吸湿性和较差的稳定性等缺点，通过微胶囊技术包埋桑枝低聚糖可改善此缺点。本研究以麦芽糊精与乳清蛋白为壁材，采用喷雾干燥法制备桑枝低聚糖微胶囊，通过单因素法确定最佳制备工艺为麦芽糊精与乳清蛋白质量比2:1，壁材与芯材质量比2:1，在此制备工艺下，微胶囊对变异链球菌的抑菌率为61.31%±3.34%，吸湿性为12.31%±1.47%，平均粒径为6.58±1.76 μm，分布均匀；通过SEM、FTIR 和XRD 验证了微胶囊的形成，桑枝低聚糖被包埋在麦芽糊精与乳清蛋白形成的复合结构中，壁材与芯材之间无化学反应，确保了桑枝低聚糖的天然性与完整性。此外，微胶囊化提高了桑枝低聚糖的热稳定性和贮藏稳定性。本研究为桑枝低聚糖微胶囊应用于口腔护理类日化用品及防龋保健食品提供理论基础，然而尚未探讨体外释药等其他特性，后续可进一步开展深入研究。