铁盐对阪崎肠杆菌的杀菌效应研究

冯程远，徐 丹，王猷胜，彭姝瑞，莫海珍，李红波，胡梁斌*

1.陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021 2.江苏中烟工业有限责任公司，江苏 南京 210019

阪崎肠杆菌是一种革兰氏阴性、兼性厌氧的条件致病菌，可在人体肠道寄生，使人感染发病。2002年，国际食品微生物标准委员会将阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长期影响”的一种致病菌[1]。阪崎肠杆菌可引起所有年龄段人群感染，其中婴幼儿为高危人群，有统计表明婴儿在阪崎肠杆菌感染后的主要临床表现有坏死性小肠结肠炎、严重的脑膜炎和菌血症，整体感染后死亡率高达20%～50%[2]。2004年，联合国粮农组织和世界卫生组织认为新生儿阪崎肠杆菌感染与婴儿配方奶粉密切相关，该菌是导致婴幼儿感染、发病和死亡的主要原因[3]。阪崎肠杆菌比大肠杆菌具有更强的耐高渗透压能力，能产生荚膜和海藻糖酶，可在奶粉中长期存活；此外，该菌还具有很强的繁殖能力，如在23 ℃只需要40 min就可以在婴儿奶粉中成长起来[4]。因此，即使奶粉中阪崎肠杆菌的污染极微量，也能在一定情况下繁殖，导致感染的发生。阪崎肠杆菌极易在不锈钢、塑料等表面黏附，形成生物膜，增强细菌对清洁剂和杀菌剂的抵抗力，导致乳制品加工管道中的阪崎肠杆菌难以彻底清除[5]。此外，阪崎肠杆菌所具有的菌毛结构能使菌形成共生集合体，抵抗抗生素[6]，若长期大量使用抗生素杀菌不仅会使微生物产生耐药性，还会污染环境[7]。

近年来对阪崎肠杆菌的防控研究越来越多，有许多物理与化学方法被提及，如Harouna等[8]发现通过功率550 W的微波仅需10 s左右即可杀灭阪崎肠杆菌；Lin等[9]发现在65 ℃射频21 h后对阪崎肠杆菌的杀菌效果显著增加；郭都等[10]发现硫辛酸对阪崎肠杆菌具有较好的抑制效果；Tian等[11]研究发现百里香酚可以通过诱导细胞膜的破损杀灭阪崎肠杆菌，降低其胞内ATP水平，使pH值下降，从而达到较好的抗菌能力。

虽然这些物理或者化学方法都可以起到抑制阪崎肠杆菌的作用，但是相关物理性的干预技术都会对乳粉中的热敏营养部分造成一定的损失，或者由于其成本较高而很难在实际生产中使用；而所使用的化学方法中，有机酸或精油都有相关安全性和特异性问题，其真正使用在婴幼儿配方乳粉中的愿景无法实现。因此，为保障婴幼儿健康，亟须开发出能安全、高效杀灭阪崎肠杆菌的杀菌剂。

此前有许多研究发现铁螯合物[12]、铁离子配合物[13]、有机酸铁盐[14-15]等具有较强的抑菌效果。我国卫生计生委此前颁布的《食品营养强化剂使用标准》(GB 14880—2012)、《食品添加剂使用标准》(GB 2760—2014)中都允许硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁等作为食品营养强化剂及食品添加剂，氯化铁也可应用于食品加工领域[16]补充铁元素，改善食品品质。本研究考察乳酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、硫酸亚铁、氯化亚铁、氯化铁5种铁盐对阪崎肠杆菌的杀菌作用，从杀菌效果、胞内ROS水平、细胞膜完整性、细胞膜脂质过氧化程度等方面探讨铁盐对阪崎肠杆菌的杀菌机制，以期为铁盐在控制食源性致病菌中的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

阪崎肠杆菌 ATCC 29544购买于美国微生物菌株保藏中心，保存在-80 ℃冰箱中。

1.1.2 培养基

胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)：称取30 g TSB干粉培养基溶于1 L超纯水，于121 ℃灭菌15 min。

胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)：称取40 g TSA干粉培养基溶于1 L超纯水，加热溶解后于121 ℃灭菌15 min。

1.1.3 试验试剂

乳酸亚铁、氯化铁、葡萄糖酸亚铁、硫酸亚铁、氯化亚铁：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；TSA、TSB：广东环凯微生物科技有限公司；碘化丙啶(PI)、活性氧荧光探针DCFH-DA：上海碧云天生物技术有限公司；脂质过氧化探针C11-BODIPY(581/591)：美国赛默飞世尔科技公司；Liproxstatin-1(Lip-1)：Med Chem Express；N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

L5分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；Pico 17高速离心机：美国赛默飞公司；Novo Cyte 300 s流式细胞仪：艾森生物杭州有限公司；Zeiss Axio Vert A1倒置荧光显微镜：德国蔡司集团；ZWY-1102C台式高速离心机：上海智诚分析仪器制造有限公司；BIONOON-200C恒温金属浴装置：上海般诺生物科技有限公司；MSC-100恒温混匀仪：杭州奥盛仪器有限公司；LHP-160E智能恒温恒湿培养箱：上海三发科学仪器有限公司；HZQ-F160全温振荡培养箱：太仓市豪成实验仪器制造有限公司；PL-303电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；SW-CJ-2FD双人单面垂直净化工作台：中国苏州智净净化有限公司；YM100L高压灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化及菌液制备

将阪崎肠杆菌划线接种于TSA培养基，于37 ℃恒温培养；然后挑取单克隆接种于TSB培养基，37 ℃、200 r/min培养12 h，将菌液以1∶100的体积比例转接至新鲜TSB培养基继续培养，直至OD600为0.8～1.2；最后用TSB培养液稀释菌液至OD600为0.1，于4 ℃、8 000 r/min离心10 min，收集菌体重悬于0.9% NaCl，备用。

1.3.2 铁盐对阪崎肠杆菌的杀菌效果研究

分别取100 μL(浓度均为3 mmol/L)的乳酸亚铁、氯化铁、氯化亚铁、葡萄糖酸亚铁和硫酸亚铁加入3 mL阪崎肠杆菌菌液中，37 ℃、200 r/min培养3 h，然后于4 ℃、8 000 r/min离心5 min，收集菌体重悬于0.9% NaCl，将菌液进行梯度稀释(100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)，每个稀释度下的菌液吸取5 μL接种于TSA培养基，于37 ℃静置培养12 h，观察阪崎肠杆菌菌落生长情况，同时以不加铁盐的菌液作为空白对照，分析铁盐对阪崎肠杆菌的杀菌效果。

1.3.3 氯化铁对阪崎肠杆菌的最小杀菌浓度(MBC)测定

分别取0、25、50、100、200 μL氯化铁(浓度为3 mmol/L)加入3 mL阪崎肠杆菌菌液中，37 ℃、200 r/min培养3 h，然后于4 ℃、8 000 r/min离心5 min，收集菌体重悬于0.9% NaCl，将菌液进行梯度稀释(100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)，每个稀释度下的菌液吸取5 μL接种于TSA培养基，于37 ℃静置培养12 h，观察阪崎肠杆菌菌落生长情况，参考文献[17]将杀死99%细菌所需最低浓度确定为氯化铁对阪崎肠杆菌的MBC。

1.3.4 氯化铁对阪崎肠杆菌细胞膜完整性的影响

将200 μL浓度为3 mmol/L的氯化铁加入3 mL阪崎肠杆菌菌液中，37 ℃、200 r/min培养3 h，然后于4 ℃、8 000 r/min离心5 min，收集菌体重悬于0.9% NaCl，向菌液中加入1 μL浓度为10 mmol/L的PI染液，37 ℃孵育20 min，然后于4 ℃、8 000 r/min离心5 min，收集菌体重悬于0.9% NaCl，用流式细胞仪和荧光显微镜观察菌液的红色荧光强度，同时以不加氯化铁的菌液作为空白对照，分析氯化铁对阪崎肠杆菌细胞膜完整性的影响。

1.3.5 氯化铁对阪崎肠杆菌胞内ROS水平的影响

向3 mL阪崎肠杆菌菌液中加入1 μL浓度为10 mmol/L的荧光染料DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，然后加入200 μL浓度为3 mmol/L的氯化铁溶液，37 ℃、200 r/min培养3 h，4 ℃、8 000 r/min离心5 min，收集菌体重悬于0.9% NaCl，用流式细胞仪和荧光显微镜观察菌液的绿色荧光强度，同时以不加氯化铁的菌液作为空白对照，分析氯化铁对阪崎肠杆菌胞内ROS水平的影响。

1.3.6 氯化铁对阪崎肠杆菌脂质过氧化程度的影响

将200 μL浓度为3 mmol/L的氯化铁加入3 mL阪崎肠杆菌菌液中，37 ℃、200 r/min培养3 h，然后于4 ℃、8 000 r/min离心5 min，收集菌体重悬于0.9% NaCl，向菌液中加入1 μL浓度为10 mmol/L的C11-BODIPY荧光探针，37 ℃孵育20 min，4 ℃、8 000 r/min离心5 min，收集菌体重悬于0.9% NaCl，用流式细胞仪和荧光显微镜观察菌液的绿色荧光强度，同时以不加氯化铁的菌液作为空白对照，分析氯化铁对阪崎肠杆菌脂质过氧化程度的影响。

1.3.7 ROS清除剂对氯化铁杀菌效果的影响

N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)是ROS清除剂[18]。铁死亡发生时谷胱甘肽(GSH)的消耗会增多，使谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)失活，导致ROS积累[19]。NAC可以通过合成谷胱甘肽(GSH)增强胞内抗氧化能力，或是直接清除ROS[20]，达到缓解铁死亡的效果。因此本研究选择通过在氯化铁处理阪崎肠杆菌前加入NAC，观察其是否对细胞死亡起缓解作用，以此判断氯化铁是否诱导阪崎肠杆菌发生铁死亡。

将阪崎肠杆菌分成3组：(1)空白对照组：菌液不做任何处理；(2)氯化铁处理组：菌液经200 μL浓度为3 mmol/L的氯化铁处理；(3)氯化铁和NAC处理组：菌液经200 μL浓度为3 mmol/L的氯化铁和30 μL浓度为50 mmol/L的NAC处理。按照1.3.3、1.3.4、1.3.5分别对上述菌液进行菌落生长、细胞膜完整性、胞内ROS水平的研究，分析ROS清除剂NAC对氯化铁杀菌效果的影响。

1.3.8 铁死亡抑制剂对氯化铁杀菌效果的影响

liproxstatin-1(Lip-1)作为铁死亡抑制剂[21]可以阻断铁死亡，可以缓解因铁死亡而发生的细胞死亡。本研究在氯化铁处理阪崎肠杆菌前加入Lip-1，观察是否对细胞死亡起缓解作用。将阪崎肠杆菌分成3组：(1)空白对照组：菌液不做任何处理；(2)氯化铁处理组：菌液经200 μL浓度为3 mmol/L的氯化铁处理；(3)氯化铁和Lip-1处理组：菌液经200 μL浓度为3 mmol/L的氯化铁和30 μL浓度为10 mmol/L的Lip-1处理。按照1.3.3、1.3.4、1.3.6分别对上述菌液进行菌落生长、细胞膜完整性、脂质过氧化程度的研究，分析铁死亡抑制剂Lip-1对氯化铁杀菌效果的影响。

1.3.9 数据处理与分析

所有试验重复进行3次，使用Origin 8.5、FlowJo 7.6 等软件对数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 铁盐对阪崎肠杆菌的杀菌效果

铁盐对阪崎肠杆菌的杀菌效果如图1所示，5种铁盐对阪崎肠杆菌均有不同程度的杀菌作用，经葡萄糖酸亚铁、硫酸亚铁、乳酸亚铁和氯化亚铁处理后，阪崎肠杆菌的存活率为25.47%～89.88%，而氯化铁处理后菌体存活率仅为0.49%，杀菌活性依次为氯化铁>葡萄糖酸亚铁>硫酸亚铁>乳酸亚铁>氯化亚铁。为深入研究铁盐对阪崎肠杆菌的杀菌机制，后续试验均以氯化铁为杀菌剂。

2.2 氯化铁对阪崎肠杆菌的MBC

如图2a所示，氯化铁对阪崎肠杆菌的杀菌效果呈浓度依赖，随着氯化铁浓度的增大，菌体存活率逐渐下降。由图2b可知，当氯化铁浓度分别为25、50、100、200 μmol/L时，阪崎肠杆菌的存活率依次为54.76%、40.51%、10.20%和0.019%。加入200 μmol/L氯化铁时，99.98%的菌体细胞被杀灭，表明氯化铁对阪崎肠杆菌的MBC为200 μmol/L。

2.3 氯化铁对阪崎肠杆菌细胞膜完整性的影响

尽管PI染料不能通过活细胞膜，却能穿过破损的细胞膜对其核染色。为进一步确证氯化铁对阪崎肠杆菌的抗菌能力是杀菌，本研究通过PI染料观察细胞。结果发现：与对照组相比，处理组中PI阳性群体也发生了同步右移(图3a)，这与2.2中的结果符合。研究还通过荧光显微镜检测，与对照组相比，氯化铁处理后阪崎肠杆菌的PI阳性群体数更多(图3b)。这表明氯化铁处理后的阪崎肠杆菌发生细胞死亡。

2.4 氯化铁对阪崎肠杆菌胞内活性氧和脂质过氧化程度的影响

由于铁死亡的特征是胞内ROS累积和脂质过氧化水平的上升，为了分析氯化铁是否导致阪崎肠杆菌死亡也伴随着ROS和脂质过氧化的爆发，本研究利用 DCFH-DA 荧光探针和C11-BODIPY 荧光探针检测活性氧和脂质过氧化水平。结果发现通过流式细胞仪和荧光显微镜结合测定氯化铁处理后的阪崎肠杆菌，其DCFH-DA阳性群体相比对照组发生了右移(图4a)，显示出的绿色荧光相比对照组更强(图4b)；与对照组相比，处理组中C11-BODIPY阳性群体也发生了右移(图4c)，且菌体的绿色荧光更强(图4d)。这说明随着氯化铁的加入，阪崎肠杆菌在发生死亡的同时，其胞内的活性氧和脂质过氧化水平均显著上升。

2.5 ROS清除剂(NAC)和铁死亡抑制剂(Lip-1)对氯化铁杀菌效果的影响

如图5所示，NAC和氯化铁处理的阪崎肠杆菌，其存活率与单独氯化铁处理组相比，由1.24%缓解到14.98%(图5a)；通过添加PI探针和DCFH-DA 荧光探针进行对细胞膜完整情况和活性氧水平的检测，在有NAC加入的氯化铁处理组中，其PI阳性群体较氯化铁处理组发生了左移(如图5b)，且红色荧光更弱(图5c)；NAC加入的氯化铁组中，其DCFH-DA阳性群体较氯化铁处理组发生了左移(如图5d)，且绿色荧光也更弱(图5e)。

如图6所示，与氯化铁处理组相比，Lip-1能使阪崎肠杆菌的存活率从1.06%上升到8.43%(图6a)；通过添加PI染色和C11-BODIPY 荧光探针分析细胞膜完整性和胞内活性氧水平，在有Lip-1加入的氯化铁处理组中，其PI阳性群体较氯化铁处理组发生了左移(图6b)，且红色荧光更弱(图6c)；Lip-1加入的氯化铁组中，其C11-BODIPY阳性群体较氯化铁处理组发生了左移(图6d)，且绿色荧光也更弱(图6e)。结合图5与图6的结果，说明NAC和Lip-1可以缓解细胞死亡的发生，这进一步表明了氯化铁的加入诱导阪崎肠杆菌发生了铁死亡。

3 讨论与结论

本研究发现了乳酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、硫酸亚铁、氯化亚铁、氯化铁等铁盐对阪崎肠杆菌均有杀菌作用，其中氯化铁的效果最强，当氯化铁浓度为200 μmol/L时，能杀灭99.98%的菌体细胞。此前已有关于铁对革兰氏阴性菌有抗菌能力的报道，杨静等[14]发现乳酸亚铁、葡萄糖酸亚铁和柠檬酸亚铁均可对变形杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌均具有抑制作用，且在pH≤4时抑制效果更好；王忠合等[13]发现麦芽酚铁对大肠杆菌有较好的抑菌效果，且可以透过细胞壁对核内物质产生影响；Gholami等[22]发现铁离子在有氧和无氧的条件下均能对大肠杆菌产生不错的杀菌效果。菌体经氯化铁处理后，细胞膜发生破损，细胞死亡，这与硫酸亚铁对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的杀菌现象一致。早期研究表明硫酸亚铁通过改变金黄色葡萄球菌等致病菌细胞膜通透性，造成细胞膜破损，引起细胞内核酸、蛋白质等生物大分子泄漏，影响ATP酶活性和能量代谢，加速细胞的死亡，并提出该杀菌机制可能涉及细胞膜上羟自由基反应[15]。本研究进一步发现氯化铁使阪崎肠杆菌胞内ROS和脂质过氧化水平显著上升，而添加ROS清除剂NAC和铁死亡抑制剂Lip-1可以降低氯化铁对细胞的杀菌效果，说明氯化铁对阪崎肠杆菌的杀菌作用为铁死亡现象。

关于铁死亡的研究，以其作为一种新型肿瘤的治疗手段越来越受到人们的关注[23]。铁死亡是一种新型的细胞死亡形式，其中铁的积累是铁死亡发生的关键因素之一[24]，这是一种铁依赖性的非凋亡式细胞坏死，体外铁过载或体内铁代谢调控异常就会导致铁死亡。铁死亡在形态学、生化和遗传学上均与细胞凋亡、坏死和自噬不同，主要特征是大量的铁离子依赖性脂质过氧化物累积[19]。铁死亡的发生涉及多种信号通路的参与，包括系统Xc-的抑制、GPX4的抑制、VDACs的激活、FSP1的抑制、铁代谢调控途径、脂质代谢调控途径等[25-28]。

由于病原细菌、病原真菌与哺乳动物同源性较低，外源性铁诱导病原菌发生铁死亡的分子机制与哺乳动物不同。如黄曲霉外源性铁死亡就不依赖于芬顿反应(哺乳动物铁死亡机制)，而是外源Fe2+进入黄曲霉胞内，激活NoxA，造成胞内ROS爆发，通过脂质过氧化引发膜损伤，导致黄曲霉孢子的坏死[29]。因此，下一步应以阪崎肠杆菌脂质过氧化的发生为切入点，深入解析氯化铁等铁盐诱导阪崎肠杆菌发生外源性铁死亡的分子机制，为开发新型杀菌剂奠定理论基础。