UPLC-MS/MS法测定禽蛋中8种氟喹诺酮类兽药残留

陈瑶， 虞冰， 马婧妤， 朱文刚， 刘莉*

(1.金华市婺城区农业农村局，浙江 金华 321017； 2.浙江省金华市农产品质量安全中心，浙江 金华 321017)

氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones，FQs)是一类全合成广谱抗菌药，广泛用于人和动物的疾病治疗[1-2]。FQs长期使用会在动物体内蓄积，影响到人类的健康，对人体的心血管系统及中枢神经系统造成不良影响，可导致呼吸肌无力，重症肌无力，甚至危及生命[3]。动物性食品中低浓度的FQs残留易产生耐药性菌株，致使有效使用剂量增加[4-6]。文献报道的FQs检测方法主要集中在环境和食品方面，有微生物法、酶联免疫吸附法、毛细管电泳法和高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用等[7-11]。

本文借鉴标准规定和相关文献的前处理方法，建立了高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)用于同时测定禽蛋中8种FQs残留，针对禽蛋试样的前处理、高效液相色谱和质谱的检测条件进行优化，为FQs残留检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

鸭蛋采购于金华市各地市养殖企业。

依诺沙星(纯度为97.51%)、氧氟沙星(纯度为99.30%)、诺氟沙星(纯度为99.10%)、培氟沙星(纯度为99.00%)、环丙沙星(纯度为99.30%)、沙拉沙星(纯度为97.70%)、达氟沙星(纯度为94.90%)、恩诺沙星(纯度为99.90%)(标准品，北京振翔科技有限公司)。无水硫酸钠、正己烷均为分析纯；乙腈、甲酸为色谱纯。实验用水(一级水，电阻率为17.65 MΩ·cm)。

1.2 仪器

LC-MS/MS 8050超高效液相色谱-串联质谱仪(日本岛津公司)；CF6RN高速离心机(日本日立公司)；BSA2202S电子天平(德国赛多利斯公司)；BSA224S电子天平(德国赛多利斯公司)；T25涡旋振荡器(德国IKA)；氮吹仪(Organomation)；HY-4调速多用振荡器(金坛盛蓝)；T6L-16G台式离心机(上海安亭)。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Shim-packGISS(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流动相：A相为0.2%甲酸水溶液，B相为乙腈/甲醇(6∶4)；流速为0.4 mL·min-1；柱温40 ℃；进样量为1 μL；洗脱方式为梯度洗脱，B相初始浓度为10%。梯度洗脱条件见表1。

表1 液相色谱流动相洗脱条件

1.3.2 质谱条件

离子化模式为ESI(+)；源温度为300 ℃；DL温度250 ℃；加热气为空气，10.0 L·min-1；加热模块温度400 ℃；雾化气为氮气，3.0 L·min-1；扫描模式为多反应监测(MRM)；干燥气为氮气10.0 L·min-1；延迟时间为3 ms；碰撞气为氩气。FQs监测离子对、碰撞能参数见表2。

表2 8种氟喹诺酮类兽药定性定量离子参数

1.3.3 储备液的配制

称取诺氟沙星(纯度为99.10%)、氧氟沙星(纯度为99.30%)、环丙沙星(纯度为99.30%)、恩诺沙星(纯度为99.90%)、培氟沙星(纯度为99.00%)各10.00 mg，称取依诺沙星(纯度为97.51%)10.225 mg，达氟沙星(纯度为94.90%)10.537 mg，将所称兽药标准品分别置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容。各吸1 mL(1 mg·mL-1)至25 mL容量瓶中得40 μg·mL-1氟喹诺酮类兽药混和标准溶液，逐级稀释至100 ng·mL-1氟喹诺酮类混标溶液。

1.3.4 样品前处理

称取(已匀浆)2.00 g禽蛋样品于50 mL离心管中，加入2 g无水硫酸钠。加入4 mL酸化的乙腈(甲酸∶乙腈1∶99，体积比)溶液，涡旋混匀，超声3 min，在4 ℃下，转速4 000 r·min-1离心5 min。将上层液(乙腈)转移至50 mL离心管中，下层液再用4 mL酸化乙腈重复提取一次，合并至离心管。提取液中加入10 mL乙腈饱和的正己烷溶液，振荡净化5 min，弃去上层正己烷。再重复净化一次。乙腈层氮气吹干。准确加入1 mL乙腈溶解，超声，涡旋混匀，再加入1 mL纯净水超声，涡旋混匀，转移至5 mL离心管，10 000 r·min-1离心5 min，过0.22 μm滤膜，待测定。

1.3.5 结果计算

按公式(1)计算氟喹诺酮类兽药残留量。

X=cV/m。

(1)

式中：X为样品中待测组分的含量(μg·kg-1)；c为测定液中待测组分的浓度(ng·mL-1)；V为定容体积(mL)；m为样品称样量(g)。

2 结果与分析

2.1 液相色谱条件

FQs结构含有羧基和哌嗪基，属于两性化合物，酸性的流动相有利于FQs形成较好的峰形[12]。本实验中以0.2%的酸性乙腈有利于峰形的改善，出峰效果好，峰形的毛刺和拖尾现象明显减少。FQs化学结构较为相似，采用0.2%的甲酸乙腈溶液使得各氟喹诺酮药物的保留时间较为理想，与干扰峰之间的分离效果好，符合检测要求。

2.2 质谱条件的优化

8种FQs目标化合物的准分子[M+H]+提取总离子色谱图(图1)。

a～i依次代表依诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、达氟沙星、恩诺沙星8种氟喹诺酮的总离子色谱图。

2.3 提取与净化条件的优化

参照文献和标准，针对FQs结构的两性特征，加酸和加碱都能提升FQs的溶解度。对于禽蛋而言，单纯使用乙腈提取，容易造成蛋白质沉淀，影响提取效果。当使用1%甲酸酸化的乙腈溶液对禽蛋进行提取时，禽蛋中蛋白质不易沉淀，同时氟喹诺酮类药物在酸化的乙腈中溶解度提高，提取液中的水分降低，提高检测的回收率。

按照《农业部781号公告6—2006鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留的量的测定高效液相色谱法》中的方法，实验结果回收率较低，很多文献也有报道[12]。采用GB/T 21312—2007《动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》中禽蛋的检测方法进行检测，也无法得到符合要求的结果。本实验采用乙腈饱和的正己烷溶液萃取，有效降低了正己烷对氟喹诺酮的吸附。这与杨嘉伟等[13]实验结果一致。C18固相萃取柱对氟喹诺酮也有一定的吸附，改为氮吹近干，可以有效提高氟喹诺酮类药物的回收率。

2.4 标准曲线、线性范围和检出限

取适量的标注储备液，用流动相初始溶液对8种氟喹诺酮类药物标准储备液进行稀释，形成系列浓度为2、5、8、10、20、50 ng·mL-1的标准工作溶液。浓度从低到高依次进样测定，每一浓度进样3次，以离子色谱峰面积为纵坐标及其相应的溶液浓度为横坐标作图，得到相应氟喹诺酮类药物的标准曲线。8种氟喹诺酮类在2～50 ng·mL-1的浓度范围内，呈良好的线性关系。将适量的标准工作溶液加到空白禽蛋中，按照1.3的实验方法处理以后，用UPLC-MS/MS检测。通过计算得到本实验方法检出限(LOD，S/N>3)，定量限(LOQ，S/N>10)。线性回归方程、相关系数、检出限、定量限见表3。

表3 8种氟喹诺酮类药物标准曲线及相关系数

2.5 方法的精密度和回收率实验

量取1 mg·L-1对照标准溶液40、80、100 μL加到2 g样品中，形成20、40、50 ng·kg-1低、中、高3个添加浓度，每个浓度3个平行，每份样品测定3次，结果取平均值，计算8种氟喹诺酮类兽残的回收率和相对标准偏差(RSD)(表4)。

由表4可知，禽蛋中8中氟喹诺酮类兽药添加样品的回收率在70.25%～113.67%，标准偏差在12.00%范围内。回收率最低的是恩诺沙星，回收率偏低的原因，可能是由于样品基质干扰影响。

表4 禽蛋中8中氟喹诺酮类兽药回收率和标准偏差

3 小结

本文建立禽蛋中8种氟喹诺酮类兽药残留检测的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定方法。该方法与普通液相色谱法和液相色谱-质谱/质谱国标法相比较，定性定量更准确，检测速度提升，分离时间缩短，方法的灵敏度和分离度以及重现性较好，稳定性高，满足禽蛋中氟喹诺酮类药物残留分析的检测要求，同时溶剂用量大为减少，分析成本降低，检测效率得到提升。该方法经系统方法验证和禽蛋中氟喹诺酮残留量例行监测应用验证，方法准确可靠，可以用来监测禽蛋中8种氟喹诺酮类药物的残留量。