尿毒症大鼠肌少症模型的造模方法及评价

吴永耀，余日臻，孙京华，闫迎华，张豪杰，刘江，裘晓蕙

肌少症是一种随年龄增长而发生的骨骼肌下降，以骨骼肌质量、力量及功能降低为主要特征的退行性综合征[1]。临床表现为肌力减退，日常活动受限，易致跌倒骨折发生，大大增加死亡风险[2]。与增龄相关的肌少症相比，尿毒症伴随肌少症临床预后更差，死亡率更高[3]。因此，建立尿毒症肌少症的动物模型就显得十分重要。慢性限制性应急，是一种慢性制动联合禁食的造模方法，是广泛被运用到情志动物模型的制作[4]，结合尿毒症患病后的临床特点[5]，对尿毒症大鼠进行慢性限制，更加接近尿毒症患者病后的一般状态，从肌少症病因学的多角度进行干预。为此，笔者拟在5/6肾脏切除尿毒症动物模型基础上联合慢性限制性应急，建立尿毒症肌少症动物模型，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 选取18个月龄雄性中老年大白鼠35只，体质量305～317 g，由宁波大学实验动物中心提供，饲料喂养3 d适应环境后造模。

1.2 动物模型的建立

1.2.1 慢性肾功能衰竭模型制造25只大鼠按经典的两步法行5/6肾切除术，一期手术切除约左肾体积的5/6；1周后，二期手术切除右侧肾脏。二期手术后4周，达到尿毒症诊断标准的有20只，随机分成两组：5/6肾切除组（尿毒症组，=10），5/6肾切除+慢性限制性活动组（造模组，=10）。余下10只大鼠为假手术组（对照组，=10），采用2次手术法，手术仅打开肾包膜，暴露肾脏约5 min后缝合肌层及皮肤。3组大鼠术后分笼饲养于室温18～25℃通风良好的环境中，正常饮食喂养4周，自由进食、饮水。

1.2.2 肌少症模型制造（尿毒症联合慢性限制性应急）将尿毒症大鼠置于束缚制动筒内，通过移动插片逐步缩小大鼠的活动空间，调节到其不产生强烈反抗的程度，每天束缚制动1次，第1天为4 h，其后根据大鼠一般情况适当增减，期间监测一般情况、体质量变化，连续16周。造模大鼠在制动期间禁食、不禁水（图1）。肌少症诊断标准参照Baumgartner等[6]的方法，模型组SI值与对照组相比显著降低，且差异大于2倍SD判定模型成功。SI值定义为靶骨骼肌的质量（mg）/受试体质量（g）求得的值。本研究以腓肠肌作为靶肌肉，使用SI作为评价指标来判断肌肉减少症动物模型成功与否。

图1 尿毒症联合慢性限制性造模法

1.3 前肢抓力测量 将大鼠前肢平放在电子抓力仪的感应杆上，当大鼠牢牢抓住感应杆后，平行拖拽大鼠尾巴，直到松开为止，抓力仪会自动记录大鼠的最大抓力。重复测量3次，取最大值为大鼠的抓力，每2周测量1次。

1.4 观察指标 实验期间每天观察大鼠的一般情况，包括外形、精神状态及食欲等。体质量指标检测每2周称重1次。

1.5 腓肠肌组织及血液标本的留取在16周末对3组大鼠进行取材，处死大鼠后，取大鼠腓肠肌称重，计算SI比值，并行HE染色法在400倍下拍照获得图像。用Image pro 6.0软件对切片图像进行分析，测量细胞的平均横截面积。

1.6 统计方法 采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差表示，多组比较采用重复测量数据的方差分析，多重比较采用SNK检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 实验期间共有3个大鼠死亡（均在行5/6肾脏切除术后），经尸体解剖检查，考虑为术后止血不彻底及合并腹腔感染所致。二期5/6肾切除初期，大鼠活动量明显减少，体质量下降，4周后体质量趋于稳定。造模组初期，大鼠出束缚制动筒后处于易激惹状态，而后期出现活动及饮食量明显减少、反应迟钝、蜷缩拱背、精神萎靡等情绪和行为的改变，与对照组和尿毒症组形成明显的反差。

2.2 抓力影响 实验前8周，3组间抓力差异无统计学意义（≤1.912，＞0.05），从第8周开始，造模组抓力出现逐渐下降的趋势，第16周时造模组抓力小于对照组（=4.42＜0.05）；尿毒症组亦较对照组有所减少，但差异无统计学意义（＞0.05）。见图2。

图2 造模期间各组大鼠大鼠抓力变化情况

2.3 大鼠体质量、腓肠肌重量及SI比值变化 对照组大鼠体质量逐渐增加；尿毒症组造模前4周体质量下降，6周后体质量趋于稳定；造模组大鼠体质量从第10周开始出现明显减少，至第16周时体质量显著减少（=7.5363＜0.05），见图3。第16周时，造模组大鼠腓肠肌重量低于其他两组（=3.675＜0.05）；见图4。第16周时，造模组SI值较对照组显著下降（=6.32＜0.05），且下降幅度大于2倍SD，提示造模组大鼠肌肉减少症模型成功；尿毒症组SI值较对照组有所下降，但差异无统计学意义（＞0.05），造模组SI值与尿毒症组差异有统计学意义（=3.95＜0.05），见图5。

图3 各组大鼠体质量变化情况

图4 16周末各组大鼠腓肠肌重量情况

图5 16周末各组大鼠SI比值情况

2.4 大鼠腓肠肌细胞横截面积变化第16周时，造模组腓肠肌细胞横截面积低于尿毒症组和对照组（=23.35，＜0.05），尿毒症组与对照组比较有所减少，但差异不明显。肌细胞横断面积的变化与腓肠肌重量的改变相一致，见图6。

图6 16周末各组大鼠腓肠肌细胞横截面积情况

3 讨论

肌少症在尿毒症血液透析患者中发病率逐渐增高，目前普遍认为与酸中毒、微炎症状态、蛋白质-能量消耗等因素密切相关，是多种风险因素与相关发病机制相互作用的结果[7-9]。临床发现尿毒症患者肌少症患病率极高，考虑除了尿毒症疾病相关外，还与患病后运动缺乏，食欲下降，以及存在焦虑抑郁心理相关。长期的运动缺乏、摄食减少及心理应激状态下肌肉组织结构功能均会发生改变，表现为肌力的减少及萎缩样变化[10-11]。本研究结合尿毒症的临床特点，将尿毒症大鼠放置于束缚制动筒内，限制其自由活动及饮食，使其正常生存本能受阻而不能表达，从肌少症病因学的多角度进行干预，使之更加接近肌少症的特性。结果发现，与其他组相比，造模组大鼠体质量在第16周时显著减少；同时，大鼠腓肠肌重量也显著下降；SI值较对照组显著下降，且下降幅度大于2倍SD，提示采用5/6肾切除+慢性限制性活动在第16周即可造模成功。与其他组相比，造模组大鼠从第8周开始出现抓力下降，在第16周时，抓力显著减少（＜0.05）；而大鼠体质量从第10周才开始出现减少，至第16周时除体质量明显下降外，大鼠腓肠肌大小、重量及肌细胞横截面积均也显著下降（＜0.05），这提示大鼠肌肉功能变化先于其形态变化。肌少症发生除了常见尿毒症致病因素外，运动、摄食减少及慢性心理应激也在其发生发展中也起着重要作用。本动物模型采用在尿毒症基础上联合慢性限制性应急在第16周时即可成功制造肌少症动物模型，该模型除了可以了解尿毒症肌肉萎缩改变外，也可以在去除慢性限制性应急后建立尿毒症肌少症逆转模型。与传统的造模方法相比，如衰老引发的肌少症需要20～24个月才能实现[12]。而下肢悬吊法以悬吊侧肢体萎缩为主，对悬吊侧肢体损伤较大，动物死亡率高，在去除悬吊解除后很难逆转肌少症。基因敲除动物模型，虽能够反映衰老的特征，然而炎症参与肌肉减少的支持缺乏依据[13]。与传统方法相比，本造模方法具有死亡率低，成模周期短，简单方便易操作，肌少症逆转模型容易实现等优点。

综上所述，采用尿毒症大鼠联合慢性限制性活动能较好地模拟肌少症过程，动物死亡率低，造模周期短，过程方法简单方便、易实现，为今后研究肌少症的发病机制及防治方法提供基础。