散结消瘿颗粒对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠氧化应激的干预作用研究

张杰，余跃，俞璐，杨涛涛，胡静波，李艺萱

自身免疫性甲状腺炎（EAT）又称桥本甲状腺炎（HT），是以甲状腺特异性自身抗体为特征的一种最常见的自身免疫性疾病[1]，属中医瘿病范畴。散结消瘿颗粒是依据明代陈实功《外科正宗》“海藻玉壶汤”，经临床辨证施治加减而成的有效验方，保留了原方中主要药味（海藻、半夏、川芎、夏枯草），具有化痰软坚、理气散结的功效。前期试验进行了散结消瘿颗粒提取工艺的优化[2]和体外抗氧化评价，发现散结消瘿颗粒能有效抑制大鼠肝匀浆自发性脂质过氧化和红细胞溶血，对铁离子有较好的还原能力及羟自由基清除能力[3]。为进一步探究散结消瘿颗粒治疗EAT的体内氧化/抗氧化平衡调控机制，本研究构建EAT大鼠模型，观察散结消瘿颗粒对NADPH氧化酶亚基p22phox、gp91phox基因和蛋白表达、超氧化物歧化酶（SOD）/丙二醛（MDA）水平的干预作用，以期阐明散结消瘿颗粒治疗EAT的潜在作用机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 实验动物：SPF级SD大鼠（200±10）g 32只，雌雄各半，购于上海斯莱克实验动物有限公司，饲养及试验均在宁波大学实验动物中心（SYXK[浙]2019-0005）进行和完成。药品：散结消瘿颗粒（浸膏）制备[2]：海藻、半夏、夏枯草药材按处方比例提取2次，第一次加水12倍量，第二次加水10倍量，提取时间均为1.5 h，滤过，合并滤液，浓缩，备用；川芎按处方比例乙醇回流提取，60%乙醇8倍量，提取3次，每次2 h，滤过，合并滤液，浓缩，与上述药物浓缩液混合，并浓缩至含生药材2.7 g/ml。试剂和来源：猪甲状腺球蛋白（PTg，酷尔化学科技有限公司），完全弗氏佐剂（CFA，Sigma公司），不完全弗氏佐剂（IFA，Sigma公司），TgAb酶联免疫试剂盒（Thermo公司），TPOAb酶联免疫试剂盒（Thermo公司），Anti-Gp91phox抗体（Abcam公司），Anti-P22phox抗体（GeneTex公司），Anti-GAPDH抗体（Proteintech公司），HRP标记的山羊抗兔抗体（碧云天生物技术有限公司），MDA和SOD测定试剂盒（均为南京建成生物工程研究所有限公司），Trizol（Invitrogen公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司），PVDF转印膜（Millipore公司）。

1.2 实验仪器 小型垂直电泳系统（Bio-Rad），多功能酶标（SpectraMax iD5），多样品组织研磨仪（净信，Tissuelyser-24），冷冻离心机（Eppendorf，5424R），超灵敏多功能成像仪（GE，Amersham Imager 680UV）。

1.3 方法

1.3.1 EAT大鼠模型的建立[4]32只大鼠适应性饲养1周后，除8只留作正常组外其余大鼠造模，PTg用0.9氯化钠注射液溶解，含量为2 mg/ml，与CFA按体积比1∶1混合，乳化成油包水乳剂，每只大鼠100g乳化的PTg多点皮下注射进行初次免疫，上述PTg溶液与IFA按体积比1∶1混合后于第2周进行加强免疫，以后每周加强免疫1次，共加强免疫4次。

1.3.2 实验动物分组和给药 正常组给予蒸馏水10ml/kg；模型组给予蒸馏水10 ml/kg；SJXY低剂量组给予散结消瘿颗粒浸膏（相当于1倍处方量）4.9 g/kg；SJXY高剂量组给予散结消瘿颗粒浸膏（相当于8倍处方量）39.2 g/kg。以上各组大鼠均在相同条件下饲养，从造模完成的24 h后按照上述剂量给药，连续给药5周。

1.3.3 标本采集 于实验末次给药6 h后，所有大鼠麻醉后心脏取血，用于检测血清SOD活性、MDA含量，然后处死大鼠，解剖并迅速取出甲状腺，pH 7.4 PBS研磨制备组织匀浆液，用于检测甲状腺组织p22phox、gp91phox基因和蛋白表达。

1.3.4 血液指标检测 大鼠心脏取血，按照试剂盒操作说明测定各组血清SOD活性和MDA含量。

1.3.5 RT-PCR按照试剂盒说明书提取各组大鼠甲状腺组织总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列：gp91phox上游引物5’-ACAAGGTTTATGACGATGAGCCTA-3’，下游引物5’-CACTGGCAGCAAGATCAGCA-3’，p22phox上 游 引 物5’-CTCTATTGTTGCAGGAGTGC-3’，下 游 引 物5’-TCAATGGGAGTCCACTGCTCAC-3’。

1.3.6 Western blot取大鼠双侧部分甲状腺组织，加入RIPA裂解液匀浆，提取总蛋白，SDS-PAGE电泳，转PVDF膜后分别加Anti-Gp91phox抗体（1∶2000）和Anti-P22phox抗体（1∶1000），4℃孵育过夜，TBST漂洗3次、每次10 min，加入HRP标记二抗（1∶1 000）、室温1 h，ECL显影、曝光，ImageJ灰度分析。

1.4 统计方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TgAb、TPOAb水平比较 模型组TgAb、TPOAb水平均高于正常组（均＜0.01），SJXY低剂量、高剂量组TgAb、TPOAb水平均低于模型组（均＜0.05）。SJXY高剂量组与低剂量组相比，TgAb、TPOAb水平均呈下降趋势（均＜0.05）。见表1。

表1 各实验组TgAb、TPOAb水平比较

2.2 SOD及MDA水平比较 模型组SOD活性降低，MDA含量升高，SOD/MDA水平低于正常组（＜0.01），SJXY高剂量组与模型组相比，SOD活性升高，MDA含量降低，SOD/MDA水平升高（均＜0.05），而SJXY低剂量组与模型组相比，SOD活性升高，MDA含量降低，SOD/MDA水平差异无统计学意义（＞0.05）。见表2。

表2 各实验组SOD/MDA水平比较

2.3 p22phox及gp91phox基因水平比较 模型组p22phox、gp91phox基因水平均高于正常组（均＜0.01）。SJXY低剂量、高剂量组p22phox、gp91phox基因水平均低于模型组（均＜0.05）。SJXY高剂量组与低剂量组相比，p22phox、gp91phox基因水平均呈下降趋势（均＜0.05）。见表3。

表3 各实验组p22phox、gp91phox基因水平比较

2.4 p22phox及gp91phox蛋白表达比较 模型组p22phox、gp91phox蛋白表达均高于正常组（均＜0.01）。SJXY低剂量、高剂量组p22phox、gp91phox蛋白表达均低于模型组（均＜0.05）。SJXY高剂量组与低剂量组相比，p22phox、gp91phox蛋白表达均呈下降趋势。见图1。

图1 各实验组p22phox、gp91phox蛋白表达结果

3 讨论

EAT发病机制涉及体液免疫和细胞免疫，但导致甲状腺组织破坏的具体机制目前仍未阐明[5]，氧化应激在EAT发病机制中起着重要作用。TgAb、TPOAb作为破坏性抗体，引起甲状腺组织损伤，活化的B和T细胞对抗TgAb、TPOAb在EAT中的作用，并通过NADPH氧化酶产生过量的活性氧，过多的活性氧引起氧化应激，进一步损伤甲状腺组织[6-7]。另一方面，EAT患者后期出现甲状腺功能减退，甲状腺激素分泌减少，使EAT患者的抗氧化酶（如SOD）活性降低，抗氧化能力减弱[8]。也有研究报道EAT患者中脂质过氧化程度增加，MDA含量增高[9]。本研究中以TgAb、TPOAb作为甲状腺组织损伤的重要标志物[10]，用来判断EAT造模是否成功，SOD/MDA比值变化用来评价机体氧化应激状态[11]。本研究结果显示模型组TgAb、TPOAb水平均升高，表明造模成功，模型组中SOD含量下降，MDA含量升高，SOD/MDA显著降低；这提示EAT大鼠外周血中存在明显的氧化/抗氧化失衡。给予SJXY低剂量、高剂量干预后，TgAb、TPOAb水平均降低，且SJXY高剂量给药还能显著提升SOD/MDA水平，表明散结消瘿颗粒能改善EAT大鼠氧化应激状态。

NADPH氧化酶是体内活性氧的主要来源，有同源物NOX1-5和DUOX1-2，被统称为NOX家族，gp91phox、p22phox为其共同的亚基，DUOX1-2主要分布在甲状腺中，参与甲状腺激素的合成[12]。多项研究表明，上调NADPH氧化酶，产生过多的活性氧，引发氧化应激反应，不仅会造成甲状腺损伤[7]，还与体内多种疾病的发生发展相关[13-14]。最近也有研究报道NOX4介导的活性氧释放参与甲状腺癌变过程[15-16]。那么下调NADPH氧化酶活性，减少活性氧释放，很可能成为减轻氧化应激损伤的有效干预手段。本研究中发现模型组大鼠甲状腺p22phox、gp91phox基因和蛋白表达均显著升高，这表明EAT大鼠甲状腺组织中NADPH氧化酶活性增高，SJXY低剂量、高剂量干预后，两组中p22phox、gp91phox基因和蛋白表达均明显降低；这表明散结消瘿颗粒能下调NADPH氧化酶活性，减少过多的活性氧产生，提示对NADPH氧化酶的活性调控很可能是散结消瘿颗粒发挥药效的靶点所在。

综上所述，EAT大鼠体内存在明显的氧化应激紊乱，散结消瘿颗粒能通过下调甲状腺组织NADPH氧化酶亚基p22phox、gp91phox基因和蛋白表达，减少活性氧产生，增加SOD/MDA水平，提升抗氧化能力，同时降低TgAb和TPOAb水平，减少甲状腺组织损伤，起到很好的治疗作用。